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微型细菌回复突变试验方法的建立 细菌回复突变试验（pmes）是国际药物注册技术协会（ich）提出的标准遗传毒性试验组合中不可或缺的一项重要试验。 因为新药研发初期需要合成多种先导化合物且每种化合物的产量往往很低, 所以需要改缩小Ames试验规模以适应高通量低耗费的研发需求 1 材料表面 1.1 材料 6孔板 (Nest) ;玻璃培养皿 (北京玻璃仪器厂) ;玻璃试管 (北京玻璃仪器厂) 。 1.2 天津市患者上的会计会计 鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型菌株:TA97、TA98、TA100、TA102 (天津市疾病预防控制中心馈赠) 、TA1535 (ATCC) , -80℃冰箱保存。 1.3 pahs大学自由基因子parpco 琼脂粉、营养肉汤培养基 (北京三药科技开发公司) ;葡萄糖 (天津风帆化学试剂有限公司) ;L-组氨酸盐酸盐 (Sigma) ;D-生物素 (Amresco) ;氧化性辅酶II (NADP, Amresco) ;D-葡萄糖-6-磷酸钠盐 (G-6-P, Sigma) ;磷酸氢钠胺 (Sigma) ;氨苄青霉素 (Amresco) ;四环素 (Amresco) 。 阳性诱变剂:敌克松 (Dexon, 南开大学馈赠) ;2-氨基蒽 (2-AA, TCI) ;叠氮钠 (Na N 1.4 代谢激活系统 大鼠肝微粒体酶 (S9) :雄性SD大鼠经苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导的肝匀浆, 无菌检测和代谢活化特性检测符合实验要求。 1.5 全温振荡培养箱、高压蒸汽灭菌器、电子天平 恒温培养箱 (SANYO) ;恒温水浴锅 (江苏金怡仪器科技有限公司) ;全温振荡培养箱 (金坛市精达仪器制造有限公司) ;高压蒸汽灭菌器 (ALP) ;电子天平 (Mettler Toledo) ;超净工作台 (无锡易纯净化设备有限公司) 。 2 方法 2.1 菌株接种及培养 配制含组氨酸-生物素、氨苄青霉素和四环素的3种底层培养基, 分别倾倒于平皿中, 约25 m L/皿。凝固后倒置放于37℃培养箱过夜以检查平板无菌。将5种菌株 (TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535) 室温融化, 根据不同菌株的特点划线接种于不同主板上 (TA97、TA98、和TA100接种于氨苄青霉素平板, TA102接种于四环素平板, TA1535接种于组氨酸-生物素平板) 。37℃培养主板48 h后于2~8℃冰箱保存备用。 从主板上分别选取3~5个单菌落接种于10m L营养肉汤培养基增菌液中, 于37℃恒温培养箱中振荡培养约10 h (120 r/min) 。试验前对以上各菌株进行如下鉴定:组氨酸缺陷鉴定 (His-) 、四环素抗性鉴定 (PAQ1) 、氨苄青霉素抗性鉴定 (p KM101) 、脂多糖屏障缺陷鉴定 (rfa) 、紫外线修复缺陷鉴定 (uvr B) 、自发回变数鉴定, 经鉴定各菌株均符合相关要求。 2.2 阳性对照诱变剂及nan微型ames试验 标准Ames试验:设置阴性对照组和阳性对照组, 2组又分别分为活化 (+S9) 和非活化 (-S9) 2个亚组。阳性对照组诱变剂分别为Dexon (-S9) :50μg/皿, 应用于TA97、TA98和TA102;Na N 微型Ames试验:组别设置同“标准Ames试验”。阳性诱变剂剂量分别为Dexon (-S9) :10μg/孔, 应用于TA97、TA98和TA102;Na N 2.3 回复突变试验 同时进行标准Ames试验和微型Ames试验2次, 将两个试验过程和数据进行对比。再重复微型Ames试验8次, 建立稳定的背景数据。 标准Ames试验:采用平皿掺入法, 各亚组均平行做3个平皿, 底层培养基约25 m L/皿。在含有2 m L顶层培养基的试管中, 加入菌液0.1 m L, 活化组加0.5 m L S9混合液, 阳性对照组再加入阳性诱变剂0.1 m L, 以上混匀后, 倒入底层培养基中, 凝固后于37℃温箱培养约48 h, 计数各组回变菌落数。 微型Ames试验:采用6孔板掺入法, 各亚组均做3个平行复孔。底层培养基为5 m L/孔, 在含有1.6m L顶层培养基的试管中, 加入菌液80μL, 代谢活化组加入0.4 m L S9混合液, 阳性对照组再加入阳性诱变剂80μL, 以上混匀后, 每孔加入540μL混合液, 凝固后于37℃温箱培养约48 h, 计数各组的回变菌落数。 2.4 阳性对照组回变菌落数实验结果验证 回复突变菌落数以ue0af±s表示, 当阳性对照组回变菌落数是阴性对照组回变菌落数的2倍或2倍以上时, 且实验数据在本实验室背景数据范围内, 判定为实验结果有效。 3 标准ames试验 如果受试菌株的自发回变菌落数在本实验室自发回变菌落数正常值范围 (表1) 内, 或偏离