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产胆固醇氧化酶菌株的复合诱变选育 胆固醇酶（cod，ec1.1.3.6）是测定胆固醇代谢过程的重要酶，能够特异性地转化为胆固醇。-4-烯-3-烯（胆甾醇）和h。 目前报道的产胆固醇氧化酶的微生物多是链霉菌和短杆菌, 其他菌种研究的较少。2001年, Tabatabaei Y M等 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 细菌 1.1.2 主试剂 亚硝基胍 (NTG) 购自德国Fluka公司;辣根过氧化物酶购自上海双向西巴斯科技发展有限公司 1.1.3 培养基的制备 种子培养基 (g/L) :牛肉膏3, 蛋白胨10, NaCl 5, 蒸馏水1L, pH7.5. 完全培养基 (g/L) :牛肉膏3, 蛋白胨10, NaCl 5, 琼脂20, 蒸馏水1L, pH7.5. 发酵培养基 (g/L) :胆固醇3, 酵母膏8, NaCl 1, CH 1.2 实验方法 1.2.1 子培养基的培养 完全培养基斜面活化48 h, 接一环到50 mL种子培养基中, 30℃200 r/min振荡培养14 h。发酵条件:500 mL三角瓶装液量100 mL, 接种量10%, 30℃200 r/min振荡培养。 1.2.2 过氧化物酶 3 mL溶液A (4-氨基-安替比林, 1 mmol/L;苯酚, 6 mmol/L;叠氮钠, 0.2 g/L;过氧化物酶, 5000 U/L;磷酸钾缓冲液, 25 mmol/L, pH7.5) , 150μm溶液B (胆固醇, 8.26 mg/mL;Triton X-100, 4.26%;异丙醇为溶剂) , 50μL酶液, 37℃, 反应5 min, 沸水浴3 min, 于500 nm测吸光值。酶活 (U/mL) =1.6832×OD 1.2.3 独立培养条件 出发菌株经完全培养基连续两次平皿活化, 接种至50 mL种子培养基, 30℃200 r/min, 培养至对数生长期 (约14 h) , 5000 r/min离心10 min, 收集菌体, pH6.0的磷酸缓冲液稀释至原体积, 振荡, 同条件离心, 反复重复2次, 制成单细胞菌悬液。 1.2.4 超声间隙处理 取出发菌悬液5 mL置于无菌玻璃试管内, 处理条件为:冰水浴, 亚硝基胍浓度为1 mg/mL, 超声200 W, 50 kHz, 超声间隙处理9次, 每次处理5 min, 其间停3 min。诱变结束后, 采用5000 r/min, 离心10 min, 收集菌体, 并用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至原体积, 振荡, 同条件离心, 反复重复2次, 除去亚硝基胍。 1.2.5 超声处理缓冲液制备 取发酵液100 mL, 5000 r/min离心10 min取菌体, 菌体悬浮于30 mL pH7.0, 0.05 mol/L磷酸钾缓冲液, 超声处理 (200 W, 50 kHz, 间歇处理, 每次5 min, 其间停1 min) 。超声4次后, 8000 r/min离心取上清, 加入20 mL甲醇振荡均匀, 静置2 h, 8000 r/min离心10 min, 取上清, 水浴蒸干, 溶解于50 mL甲醇溶液, 8000 r/min离心10 min, 取上清。 2 结果与分析 2.1 实验2:单次实验结果 采用亚硝基胍和超声波联合处理以致死率为考察指标, 复合诱变中超声波处理总时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min, 实验结果见表1。当亚硝基胍浓度为1 mg/mL, 超声处理35 min, 致死率为90%, 故确定复合诱变的条件为亚硝基胍1 mg/mL, 200 W 50 kHz超声强度, 处理35 min。 2.2 突变株的生理生化鉴定 通过筛选得到的菌株与出发菌株相比, 菌落形态特征有了很大变化。出发菌株生长前期为乳白色菌落, 边缘整齐, 表面光滑、潮湿, 后期颜色转变为棕黄色。25#突变株生长期均为桔红色, 菌落边缘整齐, 表面光滑、潮湿 (如图1, 图2) 。 为鉴定其突变类型选择了部分特征培养基进行生理生化鉴定, 实验证明与出发菌株相比, 突变株的生理生化特征没有明显变化, 目前可以确定其突变为产酶提高型和菌落颜色变化的形态突变型, 将此突变株命名为DGCCN-25。 该突变株经过8次传代接种后, 每次发酵水平相差不大, 菌种颜色无变化都为桔红色, 故可以得出结论, 该菌种遗传稳定性较稳定, 不会发生自发回复突变 (表2) 。 2.3 gccd-77对菌株产酶的影响 从图3中可以看出突变株DGCCN-25与出发菌株DGCDC-82相比, 产酶高峰提前约6 h, 产酶能力提高约140%, 这表明诱变菌株的产酶特性发生改变, 产COD活力提高, 利用胆固醇