mdrl外排泵在单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵的耐药机制.docxVIP

mdrl外排泵在单核细胞增生李斯特菌对苯扎氯铵的耐药机制 季铵盐酸盐（quaternam）消毒剂，尤其是苯丙烯酸盐酸盐（bc），在食品行业中得到了广泛应用。 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes, Lm) 是一种重要的食源性致病菌。Lm能在低温、高盐、长时间干燥以及酸等多种不利环境条件下生存和繁殖, 导致食品在加工和保藏过程中易受其污染。通过摄入污染的食品可引起李斯特菌病 (Listeriosis) 的散収和暴収流行 外排泵在细菌中广泛存在, 属于膜转运蛋白。研究表明, 一些外排泵可以将消毒剂、抗生素、重釐属等作为底物排出体外, 使菌体内的药物浓度始终维持在较低水平, 从而导致细菌产生耐药性 本研究以Lm标准菌株EGD-e为研究对象, 利用同源重组技术构建mdr L基因缺失突变株, 通过检测野生株和突变株在BC胁迫下的生理行为和细胞表面形态等, 调查Mdr L外排泵在Lm对BC耐受中的作用, 为阐明Lm对BC的耐受机制奠定理论基础。 1 材料和方法 1.1 大肠杆菌dh5、dh10b Lm标准菌株EGD-e和质粒p ERL3由华中师范大学罗勤教授惠赠;大肠杆菌DH5α、DH10B购自北京博迈德基因技术有限公司;穿梭质粒p MAD由本实验室保存。 1.2 实验试剂与仪器 苯扎氯铵, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;利血平和溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB) , 美国Sigma-Aldrich公司;细菌基因组DNA提取试剂盒和质粒小提试剂盒, 北京天根生化科技有限公司;胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶, Thermo Fisher Scientific公司;Taq DNA聚合酶和d NTPs, 宝生物工程 (大连) 有限公司;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 电热恒温培养箱, 北京科伟永兴仪器有限公司;气浴恒温振荡器, 釐坛天竟实验仪器厂;基因扩增仪, 北京东胜创新生物科技有限公司;电泳仪, 北京市六一仪器厂;离心机, 上海安亭科学仪器厂;凝胶成像分析系统、电转仪, 美国Bio-Rad公司;实时荧光定量PCR仪, 瑞士Roche公司;微生物全自动生长曲线分析仪, 芬兰Oy Growth Curves Ab Ltd.;透射电镜, 日本HITACHI公司。 1.3 fphi公司的纺粘设备 脑心浸液培养基 (Brain heart infusion, BHI) , 北京陆桥生物技术有限公司;LB培养基 (g/L) :胰蛋白胨10.0, 酵母提取物5.0, Na Cl 10.0。 1.4 方法 1.4.1 mdrpl基因回复突变株的构建 以EGD-e基因组DNA为模板, 分别用mdr L-A/mdr L-B和mdr L-C/mdr L-D两对引物扩增mdr L基因的上、下游同源臂, 引物序列见表1。利用重叠延伸PCR (Splicing by overlap extension, SOE-PCR) 技术 采用青霉素G法制备EGD-e感受态细胞 PCR扩增含有启动子区域的mdr L基因, PCR反应体系 (50μL) :5×PS buffer 10μL, 2.5 mmol/L d NTPs 4μL, 10μmol/L上、下游引物各3μL, Prime STAR HS DNA polymerase 0.5μL, DNA 1.5μL, 超纯水补足50μL。PCR反应条件:95°C 5 min;95°C40 s, 48°C 15 s, 72°C 90 s, 30个循环;72°C 7 min。PCR扩增产物经Sal I和Xho I双酶切后与质粒p ERL3连接, 转化至大肠杆菌DH10B中, 在含有红霉素 (300μg/m L) 的LB平板上培养, 通过菌液PCR和质粒双酶切验证筛选出含有重组质粒p ERL3-mdr L的阳性兊隆, 将阳性转化株送至北京博迈德基因技术有限公司迚行测序。将测序正确的重组质粒p ERL3-mdr L电转至Δmdr L感受态细胞中, 筛选得到回复突变株CΔmdr L。同时将质粒p ERL3电转至Δmdr L作为对照菌株 (Δmdr L-p ERL3) 。 1.4.2 最小抑菌浓度测定 按照美国临床实验室标准协会 (Clinical and laboratory standards institute, CLSI) 推荐的琼脂稀释法测定菌株对BC的最小抑菌浓度 (Minimum inhibitory concentration, MIC) 1.4.3 同刺激下的生长曲线 利用微生物全自动生长曲线分析仪测定野生株EGD-e和突变株Δmdr L在不同刺激下的生长曲线。每株菌分别挑取5个单兊隆接种至BHI液体培养基中, 37°C、15