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3种中草药对克氏原螯虾抗菌活性的影响 中医具有补充营养、提高身体特定功能和特定酶的功能。它具有抗菌和抑制病毒等功能。 1 材料和方法 1.1 药食和饲料 克氏原螯虾购买于荆州市钟鼓楼菜市场;陈皮、甘草、淫羊藿3种中草药购买于沙市同济大药房;虾饲料由无锡淡水渔业中心提供;金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌均为长江大学动物科学学院实验室提供。采用醇提法提取陈皮、淫羊藿和甘草的有效成分 1.2 试验虾的饲养与管理 试验选用同批次健康、大小规格相近的克氏原螯虾500多只, 随机分为4组, 其中1组为对照组 (只投喂虾饲料原料) , 其余3组分别是添加了成皮、淫羊藿、甘草的试验组。每组设置9个重复, 每个重复的水箱中暂养20只克氏原螯虾。试验期间, 所有试验虾全部养殖在水产基地的实验室内, 分别养于36只完全相同的水箱中, 室内温度20~26℃, 管理条件一致。以制备的3种中草药添加剂饲料和饲料原料进行投喂, 每天定时、定点、定量投喂。整个饲养过程中, 按克氏原螯虾常规饲养管理进行。 1.3 由薄膜跳开至心脏前转移 将克氏原螯虾的头胸甲打开, 拨开2片鳃叶, 把覆盖在心脏上方的薄膜轻轻跳开, 露出心脏;从心脏部位抽取血淋巴, 置于室温2~3 h, 用移液枪吸取血清。 1.4 细菌悬液的制备 将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、溶壁微球菌菌株接种到灭菌的LB液体培养基中, 37℃振荡培养箱培养18 h后, 离心收集底部的菌液即为细菌悬液。试验所需菌悬液的稀释:取少量的菌悬液加PBS溶液用分光光度计将其浓度调到10 1.5 u3000磷酸缓冲液、无血清蛋白以及添加磷酸缓冲液替代血清的方法 从3个实验组分别取50μL克氏原螯虾血清分别与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、容壁微球菌悬液50μL, 于EP管中放在22℃水浴振荡培养箱中培养5 h, 用磷酸缓冲液稀释1 000倍后取100μL稀释液均匀涂于LB固体培养基上, 每组重复3次, 对照组采用磷酸缓冲液替代血清, 按同样的方法进行。培养皿放在37℃培养箱中培养12~14 h后, 取出培养皿, 数出每个实验组和对照组培养基上的菌落数, 根据以下公式计算其抑菌活力大小: 抑菌率=[ (对照组菌落数-实验组菌落数) /对照组菌落数]×100% 2 结果与分析 2.13 陈皮、甘草组抑菌率的比较 3种中草药对克氏原螯虾抗大肠杆菌活性的影响见表1。陈皮、淫羊藿、甘草3种中草药均能有效地抑制大肠杆菌的生长。陈皮组和甘草组随时间增长其抑菌效果越加明显, 第7 d抑菌率分别达到40.64%和49.92%, 随后抑菌率逐渐增加, 28 d时两者抑菌率分别达到66.64%和75.97%;淫羊藿组的抑菌率在前14d较低, 在21 d时达到最高, 随后在28 d又有所下降。 2.23 色菌种抑菌率 3种中草药对克氏原螯虾抗金黄色葡萄球菌活性的影响见表2。陈皮组和淫羊藿组在第7 d时对金黄色葡萄球菌的抑菌率较低, 仅分别为16.04%和20.59%, 而14 d以后抑菌率明显上升, 在14~28 d中两组抑菌率平均达到57.12%和54.79%。甘草组对金黄色葡萄球菌的抑菌率从7 d开始就很高, 达到66.81%, 7~28 d平均抑菌率达62.74%。 2.33 d时抑菌率 3种中草药对克氏原螯虾抗溶壁微球菌活性均有明显的提高 (表3) 。陈皮组在7 d时抑菌率较低, 仅16.54%, 从14 d开始有明显的上升, 达到41.23%, 28d时达到62.74%;淫羊藿组和甘草组在7 d时抑菌率就较高, 分别达到45.48%和38.11%, 在28 d时达到57.69%和61.06%。 2.43 投喂时间对克氏原螯虾血清抑菌率的影响 3种中草药对克氏原螯虾抗嗜水气单胞菌活性的变化规律基本一致, 即随着投喂时间的增长, 克氏原螯虾血清对嗜水气单胞菌的抑菌率逐渐增加 (表4) 。成皮组、淫羊藿组和甘草组4周内对嗜水气单胞菌的抑菌率平均分别达到48.16%、49.84%和55.45%。 3 对克氏原螯虾的抵抗能力 本研究向克氏原螯虾饲料中添加淫羊藿、甘草、成皮后, 克氏原螯虾血清对各种细菌的抑菌率明显上升, 说明中草药能提高克氏原螯虾对细菌的抵抗能力。这种现象在其他鱼类中也有报道。例如, 胭脂鱼Myxocyprinus asiaticus饲料中添加0.5%的蜂胶和淫羊藿提取物连续投喂40 d后, 胭脂鱼幼鱼对嗜水汽单胞菌的杀菌百分率达到59.8%, 与对照组相比, 有显著地提高