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基于传统培养和宏基因组测序分析的泗洪小龙虾菌群多样性研究 元天竺葵通常被称为小龙虾。这是一种重要的淡水虾，其肉质细腻，脂肪丰富，分布在一些池塘的地方。自2000年以来，小龙虾餐饮业蓬勃发展，但与之相关的食品安全问题屡见不鲜。2010年，南京23人因食用小龙虾患横纹肌溶解症（Haff病） 传统培养基鉴定法是将样品处理稀释液涂布在各类选择性培养基上以获得菌种，纯化分离后再分别提取DNA，最后通过BLAST分析确定菌株类别，但该方法存在明显不足，凭肉眼筛选菌株时，人为主观意识较强，容易遗漏部分细菌。且自然界中可经人工培养的微生物仅约1%，传统培养基鉴定法无法培养出样品中所有细菌 1 材料和方法 1.1 培养基和培养基 小龙虾（体质量25～35 g），来源于江苏泗洪地区，冷鲜包装快递至实验室后进行样品处理。 平板计数琼脂（plate count agar,PCA）、甘露醇氯化钠琼脂（mannitol salt agar,MSA）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（violet red bile glucose agar,VRBGA）、营养肉汤、十二烷基硫酸盐胰蛋白酶（lauryl sulfate tryptose,LST）肉汤、脑心浸液（brain heart infusion,BHI）肉汤北京奥博星生物技术制造有限责任公司；假单胞菌琼脂基础培养基（CN琼脂）山东青岛海博生物技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1 小龙虾样品的制备 在不进行预清洗的条件下，对小龙虾样品的处理分为3种：1）以小龙虾整体为样品：称取鲜活小龙虾50 g，打碎后称取10 g置于90 mL无菌生理盐水中，均质30 min后，梯度稀释；2）以小龙虾表面为样品：选取10只大小均等、质量约180 g的鲜活小龙虾，置于225 mL无菌生理盐水中，均质30 min后，取出小龙虾，保留生理盐水并进行梯度稀释；3）以小龙虾尾肉（带虾线）为样品：无菌剥取10 g小龙虾虾仁，剪碎后置于90 mL无菌生理盐水中，均质30 min后，梯度稀释。 1.2.2 稀释液的处理 按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行小龙虾样品菌落总数测定。分别取1.2.1节中合适梯度的稀释液100μL涂布于PCA（菌落总数计数）、VRBGA（肠杆菌菌落计数）、MSA（葡萄球菌菌落计数）、CN琼脂（假单胞菌菌落计数）平板上，30℃恒温培养24 h。 将各类平板上的特征菌落分离纯化，在对应的培养基上划线2次，获得单菌落后，挑取单菌落于5 mL对应的液体培养基中，30℃振荡培养至600 nm波长处的光密度（optical density,OD 1.2.3 离心沉淀提取 取1.2.1节中的样品均质液，4℃、2 000 r/min离心10 min后，取上清液；然后4℃、12 000 r/min离心10 min后，弃上清液，收集沉淀。将提取得到的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳质量检测后，置于-80℃保存备用。 1.2.4 宏基因组测序 将DNA样品送至北京奥维森基因科技有限公司，利用Illumina MiSeq PE300宏基因组测序平台测序。微生物多样性检测选取细菌16S rDNA V3～V4区，该区扩增引物为338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’) 1.3 处理数据 所有实验重复测定3次，采用SPSS 16.0软件进行方差分析。 2 结果与分析 2.1 基于不同部位的菌落总数 由图1可知，泗洪小龙虾不同部位的优势腐败菌均为肠杆菌。小龙虾整体样品在PCA、VRBGA、MSA和CN琼脂平板上生长的菌落数分别为8.4、7.3、7.2、7.1(lg(CFU/g）），小龙虾表面样品分别为7.1、6.7、6.7、6.2(lg(CFU/g）），小龙虾尾肉样品分别为7.0、6.4、6.1、6.0(lg(CFU/g））。泗洪小龙虾不同部位的菌落数有一定差别，尾肉样品的菌落数较低。一方面可能是由于小龙虾体表外骨骼中的几丁质具有致密结构，能有效阻拦微生物入侵 庄秋丽等 2.2 基于同源性的pcr检测 通过平板划线法，根据4种平板培养基上菌株的形态，分离得63株菌。将每株菌进行16S rDNA扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。在2 000 bp与1 000 bp之间出现特异性条带即为成功扩增样品，对获得特异性条带的PCR产物进行测序分析。将测序所得序列进行NCBI BLAST分析，选取同源性98%以上的菌株序列，确定菌株种属 由表1可知，泗洪小龙虾不同部位分离所得63株菌中大多数菌株均属于肠杆菌科，其中32株菌为柠檬酸杆菌属。柠檬酸杆菌在自然界中普遍存在，易引起水产动物感染发病 2.3 小龙虾样品总菌原