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两种一种方法鉴定结核分枝杆菌复合群的初步研究 淋巴结是一种严重的全球疾病。根据who的报告，2011年，世界上有860万个新病例，其中140万人死亡。 1 材料和方法 1.1 h23rv 204株临床分离菌株来自重庆医科大学附属儿童医院, 标准菌株 (H37Rv) 由重庆市疾病预防控制中心提供。临床分离株按照结核病诊断实验室操作规程进行初步鉴定, 根据其在罗氏培养液、对硝基苯甲酸及噻酚-2-羧酸肼生长情况, 鉴定是否为结核分枝杆菌及排除污染菌株 1.2 方法 1.2.1 研磨酶tween 取二氧化碳温箱中酸性罗氏培养液培养阳性的结核分枝杆菌, 每株菌取约1环, 放入盛有5%tween+3 ml生理盐水的磨菌瓶中, 震荡研磨。取上述震荡液约200μl, 放于中性罗氏培养液中, 37℃培养箱培养4~8周。 1.2.2 cidl--噻酚-2-羧酸的合成 参照文献[3]方法, 对临床结核分枝杆菌分离株采用对硝基苯甲酸 (p-nitrobenzoic acid, PNB) /噻酚-2-羧酸肼 (thiophene-2-carboxylicacid hydrazide, TCH) 培养液鉴定。PNB、TCH均 (+) 为非结核分枝杆菌, PNB、TCH均 (-) 为牛结核分枝杆菌, PNB (-) 、TCH (+) 为结核分枝杆菌 (表1) 。 1.2.3 基因序列和对引物的合成 主要PCR试剂 (2×Taq PCR Master Mix, 100 bp DNA ladder) 购于天根生物技术有限公司, 引物由上海生物工程有限公司合成。全基因组提取试剂盒购于上海生工生物有限公司。全基因组DNA提取参照文献[4]的标准方法。参照文献[5]方法, 选择在结核分枝杆菌复合群中分布具有差异的基因, 合成7对引物分别扩增分枝杆菌的16Sr RNA基因、Rv0577基因、IS1561’基因、Rv1510基因、Rv1970基因、Rv3877/8基因及Rv3120 (表2) 。同时参照文献[6]的方法, 选择4个基因 (基因序列来自结核分枝杆菌基因库http://genolist.pasteur.fr/Tubercu List/) , 合成4对引物, rop B基因、RD1基因、RD8 (present) 基因、RD8 (deleted) 基因 (引物序列合成应用Primer 3软件, /, 表3) 。③PCR扩增体系及条件, 7位点PCR反应体系为20μl, 其中前后引物各1μl, 2×Taq PCR Master Mi x 10μl, DNA模板1μl, dd H 2 结果 2.1 以往pnb与tsh的鉴定结果 传统PNB/TCH鉴定结果显示, 204株临床分离株, 有199株结核分枝杆菌, 3株牛结核分枝杆菌, 2株非结核分枝杆菌。 2.24 牛失林分枝杆菌/卡介苗/分枝杆菌5株 4位点PCR鉴定结果显示, 结核分枝杆菌196株, 2株牛结核分枝杆菌, 3株卡介苗, 非结核分枝杆菌有3株 (图1) 。与传统PNB/TCH鉴定结果比较, 两者间的符合率达99.0% (199/201) 。 2.37 pcr鉴定结果 7位点PCR鉴定结果显示, 结核分枝杆菌有190株, 2株牛结核分枝杆菌, 3株卡介苗, 4株非洲分枝杆菌Ⅰ型, 山羊分枝杆菌和田鼠分枝杆菌各1株, 非结核分枝杆菌有3株 (图2) 。与传统PNB/TCH鉴定结果比较, 两者间的符合率达96.01% (193/201) 。 7 位点与4位点PCR鉴定结果比较, 两者间的符合率达96.98% (193/199) 。7位点与4位点的差异在于鉴别出4株非洲分枝杆菌, 及田鼠分枝杆菌和山羊分枝杆菌各1株。 3 小鼠失血性肝炎中ropb基因和pnb/tch的表达 本研究采用多位点PCR方法对儿童结核分枝杆菌进行菌种鉴定。目前临床实验室菌种鉴定使用的传统方法是PNB/TCH, 该方法报告时间为4周, 阴性报告时间需要8周, 对儿童结核病的早期诊断和治疗非常不利, 且只能鉴定结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌, 还受细菌生长速度的影响。在全国耐药基线调查中评价4 069株结核分枝杆菌的PNB/TCH鉴定显示, TCH鉴别牛结核分枝杆菌的效率特别低, 难以作为牛结核分枝杆菌鉴定的有效依据 多位点PCR是近年来发展起来的鉴定结核分枝杆菌的新方法。4位点PCR方法在国内首次用于结核分枝杆菌临床分离株的菌种鉴定。研究证明, rop B基因可以在所有结核分枝杆菌中表达, 但是在其他菌种中不能表达 本研究采用4位点和7位点两种PCR方法进行鉴定, 结果显示两种多位点PCR方法与PNB/TCH方法的符合率均90%, 7位点PCR方法与传统PNB/TCH的符合率与国内相关文献报道一致 本研究所鉴定的3株卡介