草间钻头蛛共生菌的筛选及感染对宿主发育的影响.docxVIP

草间钻头蛛共生菌的筛选及感染对宿主发育的影响 共生菌通常存在于动物体的细胞和组织中（buule等人，2010），这对主枝的繁殖和生长有一定的影响（mcfall-ngar，2002；wreen等人，2008；布局顿等人，2012）。根据共生菌与宿主的相互作用, 有专性共生菌与兼性共生菌之分 (Moran, 2006) , 前者为宿主提供生存所必需的营养物质, 与宿主是互利共生关系, 蚜虫体内的布赫那氏菌Buchnera是这类共生菌的典型代表 (Douglas, 1998;Wilson et al., 2006;单红伟等, 2016) ;后者不是宿主生存所必需, 但也会对宿主的生殖和适合度有一定影响 (Gunnarsson et al., 2009;云月利等, 2013;李迁等, 2016) 。为了更加深入研究宿主与共生菌的相互作用, 国内外学者先后开展了大量关于共生菌感染检测的研究, 但多集中于对常见内共生菌沃尔巴克氏体Wolbachia和Cardinium在昆虫纲宿主中的分布 (MartinGoodacre, 2009;Atyame et al., 2011;Bian et al., 2013) 及其对宿主生殖的影响研究 (Perlman et al., 2008;Fast et al., 2011;Blagrove et al., 2012) , 未能对宿主体内的共生菌群落进行全面测定。近年来高通量测序技术的出现, 为全面深入了解宿主体内的共生菌群落提供了技术平台, 关于昆虫共生菌多样性研究已开展了部分工作 (Bili et al., 2016;Muturi et al., 2016) , 但迄今为止, 还未对蜘蛛体内的共生菌进行深入研究。蜘蛛作为一种农林害虫的天敌, 开展蜘蛛体内共生菌多样性及共生菌对宿主生殖和适合度影响的研究将为更好地利用蜘蛛进行害虫生物防治提供重要的前提和基础。 蜘蛛内生菌的研究较昆虫内生菌起步晚, 但也有大量研究证明蜘蛛体内含有沃尔巴克氏体 (Rowley et al., 2004;Wang et al., 2010) 、Cardinium (MartinGoodacre, 2009) 和Spiroplasma等多种内生菌 (Goodacre et al., 2006;Jin et al., 2013) , 且部分共生菌种类对宿主的生殖和适合度有一定程度的影响 (云月利等, 2013;Vanthournout et al., 2014;VanthournoutHendrickx, 2016) 。但由于蜘蛛自相残杀的习性, 其室内养殖必须单头单管进行, 使得蜘蛛的大规模人工养殖尚未实现。再加上部分蜘蛛种类发育历期较长 (Foelix, 2011) , 故关于共生菌感染对蜘蛛发育历期的影响研究一直未见报道。 为了更加深入全面地了解蜘蛛共生菌群的组成及共生菌对宿主发育历期和性比的影响, 本研究以个体小、年发生代数多、室内养殖方法较为成熟的草间钻头蛛Hylyphantes graminicola为材料, 通过高通量测序细菌16S r RNA的V3、V4区, 对草间钻头蛛体内的共生菌群进行测定, 并采用普通PCR法对草间钻头蛛体内的优势共生菌感染率进行检测, 在此基础上研究优势共生菌感染对草间钻头蛛子代的发育历期及性比的影响, 以期为更好地发挥蜘蛛作为农林害虫天敌的生物防治作用提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 饲养和试剂 供试蜘蛛:成熟的草间钻头蛛于2015年7月采集于河南省洛阳市裴村的玉米植株上, 该玉米田无农药使用史。用1.5 cm×5.0 cm指形管于田间单头单管收集该蜘蛛, 以脱脂棉球塞住管口, 防止逃逸。将采集到的167头雌性草间钻头蛛转入室内智能人工气候箱中, 于温度28±1℃、相对湿度 (65±5) %、光照周期16 L∶8 D条件下用本实验室培养的不含沃尔巴克氏体的黑腹果蝇Drosophila melanogaster饲养, 产子代后备用。 试剂:Dneasy BloodTissue Kit DNA提取试剂盒, 德国Qiagen公司;DNA Marker, 天根生化科技 (北京) 有限公司;其余试剂均为国产分析纯。 仪器:智能人工气候箱HP250-GS-C, 武汉瑞华仪器设备有限公司;奥林巴斯Olympus SZX7体式显微镜, 日本Olympus公司;Nano Photometer NP80Touch微量核酸蛋白检测仪, 德国Implen Gmb H公司;Molecular Imager 1.2 方法 1.2.1 细菌16srdna的生物组织学检测 选取10头经饥饿处理15 d的草间钻头蛛雌蛛, 超声清洗蜘蛛表面3 min, 再用无菌水清洗3次后, 用DNA提取试剂盒分别提取每头蜘蛛的