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kozak基因重组智能腺病毒载体的构建及表达研究 基因治疗是将具有治疗作用的基因或dna（rn）段引入人体的靶细胞，相应地调节不同类型疾病的分子变化，并发挥治疗作用。基因治疗的研究和应用起源于对遗传病的治疗,但近年来肿瘤基因治疗的发展却远远超过了遗传病。 常见的抗癌基因有p53、p21、p27、p16、PTEN、FHIT、BRCA1/BRCA2等。由于在人类恶性肿瘤中有 50%带有p53基因突变,且p53基因的突变与病情的发展、肿瘤的转移以及对放、化疗的敏感性和预后均密切相关,因此该基因在目前的肿瘤基因治疗研究中倍受关注。p53的基本功能为核转录因子,其抗肿瘤的生物学活性主要表现在阻滞肿瘤细胞周期,可作用于G1/S期和G2/M期,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤血管生成,增强肿瘤细胞的免疫原性,抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,增加肿瘤细胞对放、化疗以及热疗的敏感性等。 重组人p53腺病毒应用于临床治疗恶性肿瘤已有十几年的历史,虽然取得了一些令人满意的疗效,但疗效尚不十分确切。究其原因,主要是由于p53蛋白在肿瘤细胞中的表达量相对不足所致。本研究利用一种新的重组腺病毒载体系统AdMaxTMHi-IQ,并在基因5′端加入Kozak规则序列,最终同时实现了重组腺病毒的高效包装与p53基因的高效表达。 1. 材料和方法 1.1 细胞培养和动物 AdMaxTMHi-IQ重组腺病毒载体系统pDC515 (io)、pBHGfrt(del)E1、3FLP等质粒和293IQ细胞购自北京本元正阳基因技术有限公司;pUCmT载体购自上海生工生物工程技术服务有限公司;人骨肉瘤Saos-2细胞和人肺癌A549细胞由广州中山大学实验动物中心提供;人p53 cDNA由本公司克隆并保存。 1.2 生物工程技术服务 TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司;Trizol reagent 购自invitrogen;Fermentas Rebert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit购自上海生工生物工程技术服务有限公司;鼠抗人p53一抗、HRP-人p53二抗购自尚柏生物医学技术(北京)有限公司;Lipofectamine 2000转染试剂购自广州展晨生物科技有限公司。 1.3 koraralataqtmnda分析 根据已发表的人野生型p53 cDNA全序列,设计合成2条引物,上游引物P1:5′-ATAGGATCCACCATGGAGGAGCCGCAGTC-3′;下游引物P2:5′-ATAGGATCCATGTCAGTCTGAGTCAG-3′,上下游引物中均插入BamH I酶切位点GGATCC和酶切保护碱基ATA,并在上游引物BamH I酶切位点后加入一个A碱基,上游引物内整合入Kozak规则序列CCACCATGG。以上述人野生型p53 cDNA为模板,采用TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶,通过PCR扩增人p53肿瘤抑制基因编码区,反应条件为:94℃ 2 min;94℃ 30 s,45℃ 40 s,72℃ 60 s,30个循环;72℃延伸5 min。PCR产物与pUCmT载体连接,转化大肠杆菌DH5α(深圳市源兴生物医药科技有限公司李进研究员惠赠),蓝白斑筛选pUCm-khp53阳性重组子,再用上游引物P3:5′-AGCACTGTCCAACAACACCA-3′和下游引物P2进行PCR筛选,酶切鉴定后,进行双向测序鉴定。 1.4 bamhi酶切鉴定 用BamH I酶切pUCm-khp53 和腺病毒穿梭载体pDC515(io),琼脂糖凝胶电泳后分别切胶,回收插入片段与载体片段,以摩尔比为3∶1的比例连接,转化大肠杆菌DH5α,用引物P3和P2经PCR初筛出阳性克隆,再在载体多克隆位点的上游设计1条与正链一致的引物P4:5′-ACATCCACTTTGCCTTTCTC-3′,在基因内设计1条与正链互补的引物P5:5′-GGGAC AGCATCAAATCATCC-3′,基因若正向插入可扩增出片段,若反向插入则无法扩增出片段,以此鉴定基因插入方向,并进行BamH I酶切鉴定。鉴定正确的载体命名为pDC515(io)-khp53。 1.5 mdv细胞重组人马立克氏体诱导 pDC515(io)-khp53腺病毒基因组骨架DNA即pBHGfrt(del)E1,3FLP等质粒的大量扩增、提取、纯化和定量参见文献方法。将293IQ细胞复苏、扩增并铺板,用Lipofectamine 2000转染试剂介导pDC515(io)-khp53与腺病毒基因组骨架DNA(DNA总量为800 ng,摩尔比为1:1)共转染293IQ细胞,同时设未感染病毒的细胞为阴性对照,8 d后共转染孔细胞出现细胞病变,而阴性对照孔细胞生长正常,初步可以判定