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dehp对子代大鼠神经行为的影响 塑化剂dep的中文名字叫二苯二甲酸二酯（2-乙基），也被称为二苯二甲酸二异丙酯。它是二甲苯二甲酯（pae）的重要成员。广泛应用于食品材料、容器、医疗用品和人类疾病的加工应用。作为原料，它也可以用作香剂和沐浴精。这是一种广泛用于工业的增塑剂。世界年产量可达300-400万吨。由于DEHP是脂溶性的,不以共价键结合于PVC分子上,因此,随着使用时间的推移,可不断地从膜中释出,挥发至大气、土壤和水域中,造成对环境、生物、食品的污染。世界卫生组织、美国食品与药品监管局和欧盟分别认为,对于60 kg体重的人来讲,每天摄入1.2、2.4和3.0 mg的DEHP是安全的。但是,随着DEHP产量的逐年增加,其在环境中的浓度也逐年升高,对人体的毒性作用也越来越受到关注。尤其2011年5月24日以来,发生的“塑化剂”事件对于公众健康的严重危害已引起台湾及大陆地区的广泛关注。因此,目前国内外许多国家已经开始重视对DEHP的毒性研究、危险度评价及安全性监督。 近年来DEHP被认为是一种环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptor,EED),已成为全球最普遍的污染物之一,并被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物,表现为生殖生长、肝、肾及血液等方面的毒性。DEHP的急性毒性较低,有研究报道经口给药后,小鼠的LD50为30 g/kg,大鼠为30.6 g/kg。对于DEHP神经发育毒性问题,国内外相关报道较少,Andrade等研究认为DEHP孕期染毒使新生幼鼠下丘脑视前交叉芳香化酶(Acrom atase)表达减低,并其对活性产生影响。另外,有研究证明DEHP可以干扰神经类固醇水平,由于芳香化酶是合成神经类固醇的重要酶类,而神经类固醇对于学习记忆、认知功能的调控具有重要意义,故有人推测DEHP通过影响神经类固醇水平而影响学习记忆认知功能。因此,DEHP导致神经系统损伤的机制可能是通过影响芳香化酶开始的。 人类可广泛暴露于邻苯二甲酸酯类物质,其中女性因使用含邻苯二甲酸的化妆品和个人护理用品成为邻苯二甲酸酯的高危人群,DEHP可以通过胎盘屏障进入胎儿体内,在胎儿体内聚集,也可直接作用于胎儿。但如果在孕期接触DEHP,由于胎儿的血脑屏障尚未发育完成,DEHP可能通过胎盘进入胎儿的中枢神经系统,从而影响到子代的脑发育。本实验拟通过孕期大鼠暴露DEHP建立子代大鼠神经系统损伤的动物模型,通过观察DEHP所致子鼠神经行为学相关指标的变化,探讨DEHP对发育中子鼠神经系统的影响,为其神经发育毒性机制深入研究提供相关理论依据。 1 材料和方法 1.1 仪器和试剂 DEHP(分析纯,美国Sigma公司);Trizol(美国Sigma公司);三氯甲烷(分析纯,北京北化精细化学品有限责任公司);异丙醇(分析纯,山东蜀王实业公司);RT-PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司);引物合成(金思特科技南京有限公司)。紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);EPS300电泳仪(上海天能科技有限公司);PCR扩增仪(日本株式会社);恒温水浴箱(HH-42型,常州国华电器有限公司);低温高速离心机(CF15D,上海日立工机株式会社)。 1.2 大鼠阴栓治疗 动物染毒:清洁级Wistar大鼠雌性28只,雄性大鼠10只,体重220~250 g,由中国医科大学实验动物中心提供,许可证号:SYXK(辽)2011-0005。适应性饲养1周后按体重随机分为4组,每组7只。动物交配:雌雄大鼠以1∶1同笼,次日晨于盘底及阴道检查阴栓,查出阴栓者,记为妊娠0 d,母鼠编号称重,另笼饲养,同时进行如下处理。对照组(给与玉米油);低剂量组:10 mg/(kg·d)DEHP;中剂量组:100 mg/(kg·d)DEHP;高剂量组:500 mg/(kg·d)DEHP。实验各组动物自由饮水,连续染毒19 d至子鼠出生。每7 d称重1次。动物室温度18℃~23℃,相对湿度45%~55%,于出生后6周进行水迷宫和电穿梭试验。试验完成后,子鼠经乙醚麻醉后断头处死,取海马组织,保存于-70℃深冻冰箱,用于RT-PCR分析。 1.3 观察指标和测试方法 1.3.1 子鼠的素质训练 对出生后6周子鼠进行水迷宫训练,水迷宫由一黑色有机玻璃长方体水槽(73×42×20 cm)组成,其中有若干隔板组成迷宫,其中有4个盲端,迷宫的一角有一组台阶为终点。实验前,迷宫中灌水,水深10 cm,水温(24±1)℃。训练第1天用隔板将两个最近距离的通道阻断,子鼠被置于台阶上10 s,使其了解此安全区域的存在,然后将子鼠放于起点,让其自由游泳,记录其进入盲端1的次数(即错误次数)以及爬上安全台阶的时间(即潜伏期),如果在训练时间2 min内尚未找到台