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3株滇重楼内生真菌的生物自显影-m分析 植物内源性是指在生活史上一定阶段或所有阶段生活在植物组织或器官中，对主枝植物没有显著的疾病和症状。植物内生真菌是一个巨大的活性物质资源库,目前从植物内生真菌中探寻新型活性物质日益成为研究热点,对于植物内生真菌的开发,从中寻找新的抗菌活性物质无论是在医药工业、农业还是在食品工业等方面都有着巨大的潜力。植物内生真菌普遍存在着抗菌活性,近年来人们先后从植物内生真菌中发现了多种抗菌活性物质,主要有生物碱、萜类、甾体类、黄酮类、肽类、脂肪族类、酚类和苯丙素类等。 薄层层析-生物自显影法(TLC-Bioautography)是近年来应用的一种将薄层层析和生物活性测定相结合的抗菌活性物质检测方法。利用薄层色谱的分离能力将少量混合物(如植物提取物、微生物代谢产物等)在薄层板上通过展开剂展开后,使薄层板与含有供试微生物的培养基相接触,在一定条件下培养一段时间后,非活性部位会被生长出的供试微生物所覆盖而呈现背景色;活性部位由于抗菌成分的存在,指示微生物的生长受到抑制而呈现抑菌斑点,这样就可以初步了解混合物抗菌活性成分的相对极性,为活性单体化合物的分离提供依据。采用TLC-生物自显影法检测植物内生真菌提取物中抗菌活性成分鲜见报道,本文在TLC-生物自显影的基础上结合细胞活力MTT测定方法,对3种滇重楼内生真菌菌液和菌丝正丁醇提取物中抗菌活性成分进行了检测,为进一步分离纯化内生真菌中抗菌活性成分提供了依据。 1 材料和方法 1.1 聚羧酸pahs和双性霉素bachotericinb 噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]购自美国Amresco公司,用pH 7.2、0.2mol/L的磷酸缓冲液(PBS)配成0.5 mg/mL的溶液;98%硫酸链霉素(Streptomycin sulfate)购自石家庄曙光制药厂,用无菌水配成0.2 mg/mL的溶液;两性霉素B(Amphotericin B)购自美国Amresco公司,用无菌水配成0.2 mg/mL的溶液;95%多菌灵(Carbendazim)购自江苏吴县市农药厂,用无菌水配成0.1 mg/mL的溶液。以上溶液均于4 ℃避光保存,其它试剂均为国产分析纯。 光照培养箱(HPG-280B,哈尔滨),摇床(GFL-1083,Japan),旋转蒸发仪(RE50,Yamato,Japan),紫外分光光度计(TU-1810,普析通用,北京),GF254nm硅胶板(青岛海洋化工集团)等。 1.2 马铃薯葡萄糖的生长和提取 内生真菌为本实验室从滇重楼(Paris polyphyllavar.yunnanensis)的根状茎中分离到,芬芳镰刀菌(Fusarium redolens,缩写Fur,GenBank登录号EF495234)、季氏毕赤氏酵母(Pichia guilliermondii,缩写Pig,GenBank登录号EF495244)和烟曲霉(Aspergillus fumigatus,缩写Asf,GenBank登录号EF495242)。从试管斜面上挑取少许菌丝到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato dextrose agar,PDA)平板上活化3 d,然后将活化的菌丝接种于1000 mL的三角瓶中,每瓶装250 mL 马铃薯葡萄糖(Potato dextrose,PD)液体培养基,每种真菌培养2瓶,共500 mL培养液,在25 ℃,150 rpm下培养7 d后收获。将获得的培养液真空抽滤,收集滤液和菌丝,滤液用等体积的正丁醇萃取3次;菌丝经冰冻干燥后研磨,然后用正丁醇超声提取3次,每次1 h。正丁醇萃取液和提取液分别在50 ℃下减压浓缩,分别获得菌液的正丁醇萃取部分和菌丝的正丁醇提取物样品。 1.3 菌种的活化和培养 供试细菌有:大肠杆菌(Escherichia coli,G-)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,G+);供试真菌有:白色念珠菌(Candida albicans)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)。以上菌株均由中国农业大学植物病理学系提供。 细菌的活化和培养采用LB培养基。挑取单菌落接到25 mL LB液体培养基中培养24 h(250 rpm,37 ℃),然后将菌液稀释为108CFU/mL(0.5麦氏标准),待溶化后的LB培养基(琼脂含量为0.5%)温度降至40~50 ℃之间,取1 mL菌液(108CFU/mL)加入到100 mL培养基(细菌最终浓度为106CFU/mL)中,迅速摇匀,待用。 白色念珠菌的活化和培养采用PDA培养基。挑取单菌落接入到25 mL PD液体培养基中培养48 h(250 rpm,28 ℃),用PD培