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dehp胚胎期暴露对神经行为发育的影响 二聚苯二羧酸（2-乙基）的异构体（dep）属于二聚苯二羧酸（dep），是塑料工业中最重要的增塑剂之一。由于塑料制品的广泛应用及DEHP易于从塑料制品中迁移出来的特性,DEHP在环境中的浓度也逐渐升高,造成严重污染。DEHP是一种环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptor,EED),表现出生殖毒性、肝肾毒性及致癌性。另外通过动物的胚胎毒性研究发现,DEHP还具有发育毒性。人类可广泛暴露于邻苯二甲酸酯类物质,其中妇女因使用含邻苯二甲酸的化妆品和个人护理用品成为邻苯二甲酸酯的高危人群,DEHP可以通过胎盘屏障进入胎儿体内聚集,也可直接作用于胎儿。如果在孕期接触DEHP,由于胎儿的血脑屏障尚未发育完成,DEHP可能通过胎盘进入胎儿的中枢神经系统,从而影响到子代的脑发育,造成神经毒性的损害。本研究拟通过子代大鼠胚胎期暴露DEHP,观察DEHP所致子鼠行为畸胎学、神经行为学相关指标的变化,评价DEHP与子代大鼠神经系统损伤的关联。另外,通过DEHP对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响,探讨DEHP可能的发育神经毒性机制。 1 材料和方法 1.1 仪器、仪器和仪器 Fura-2探针,日本同仁化学研究所;DL-5型低速大容量离心机(上海仪器仪表有限公司);F-2000型荧光分光光度计,日本日立公司产品;水迷宫(SMG-2型),淮北正华生物仪器有限公司;穿梭箱(DSX-2型),淮北正华生物仪器有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及处理 清洁级Wistar大鼠[许可证号:SYXK-(辽)2008-0005]38只,其中雄性10只,雌性28只,体重220~250 g,由中国医科大学实验动物中心提供。适应性饲养1周后按体重随机分为4组:对照组和低、中、高剂量组,每组7只。动物交配:雌雄大鼠以1∶1同笼,次日晨于盘底及阴道检查阴栓,查出阴栓者,记为妊娠0 d,母鼠编号称重,另笼饲养,同时进行如下处理。对照组:用玉米油灌胃;低剂量组[10 mg/(kg·d)DEHP]:用含0.1%DEHP的玉米油溶液灌胃;中剂量组[100 mg/(kg·d)DEHP]:用含1.0%DEHP的玉米油溶液灌胃;高剂量组[500 mg/(kg·d)DEHP]:用含5.0%DEHP的玉米油溶液灌胃,连续染毒19 d至子鼠出生。根据大鼠生活习性早8时禁食,下午14时DEHP灌胃,各组孕鼠自由摄食饮水。动物室温度18~23℃,相对湿度45%~55%,孕鼠产仔后,单独一笼哺养幼鼠。 1.2.2 小鼠海马神经元模型 (1)子鼠开眼时间:于子鼠生后第10天开始观察,直到所有子鼠双眼均开放,计算平均开眼时间。 (2)子鼠断乳前神经反射发育指标:观察各指标子鼠达标的平均时间,每只子鼠进行3次实验,取2次或以上相同者为其结果。 (a)平面翻正反射实验于子鼠生后当天,将其仰面置于一平面上,在5 s内完全翻正即四脚着地为正常。 (b)负趋地性反射实验于子鼠生后第4天,在一倾斜25°的底板上将子鼠头朝下摆正,2 min内调转头位180°为正常。 (c)断崖回避反射实验于子鼠生后第5天,将子鼠头朝前放在悬空的平面边缘,前两爪悬空,观察4 s,若子鼠向后退到前两爪完全回到悬空的平面上为正常。 (d)触须定位反射实验于子鼠生后第10天,捉住子鼠尾巴,头面向平面边缘,触须刚刚垂直接触平面表面,子鼠应抬头,前肢向平面方向伸展。 (e)听觉惊愕反映实验于子鼠生后第12天,将子鼠单独置于一鼠笼里,待动物平静后,突然关闭鼠笼,发出啪的一声刺激子鼠。阳性反应为:身体突然卷缩、拱起或急剧一跳。 (f)空中翻正反射实验于子鼠生后第14天,将子鼠背向下从30 cm高处自由向一棉垫落下,观察子鼠着地时体位。正常者应落下后面向下呈俯卧状态,至少三脚着地。 (2)神经行为学测定 (1)水迷宫试验:将出生后6周的子代大鼠进行水迷宫训练,连续训练2次,记录水迷宫错误次数及潜伏期,如果在2 min内找不到台阶者,将被引导到终点,其潜伏期被记为2 min。 (2)电穿梭试验:将出生后6周的子代大鼠置于穿梭箱箱体中,盖好盖,点击实验开始,大鼠在中间状态起始时,挡住左边或是右边任一光线,则该次穿梭结束。若起始状态是左边,则挡住右边的光线视为完成一次穿梭,反之亦然。在峰鸣阶段完成穿梭叫主动逃避,在电刺阶段完成穿梭叫被动逃避,反复循环直到设定的次数并记录。 (3)大鼠海马神经元细胞内Ca2+浓度测定取出生后21 d大鼠海马组织,置备大鼠海马单细胞悬液,(经台盼蓝排斥实验检测,细胞存活率达95%以上,调整细胞浓度至1×106个/ml)。加入Fura-2/AM 5μl(终浓度2.5μmol/L)黑纸避光,37℃培养箱中孵育45 min后,2000 r/m