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mir-21与lr4靶向调控关系的构建 mirna（mirna）是一个长度约为22nm的非编码单链小rna分子。与目标基因3（3）utr）的异质结合，特异性导致mrna的分解，抑制蛋白质的合成，并导致靶基因的沉淀。miRNA存在于多数真核生物中, 具有高度的保守性、 组织特异性和时空性。其中miRNA-21是近年来发现重要的miRNAs分子之一, 是位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上, 且具有自主转录单位的一种miRNA, 在肿瘤的发生、 细胞信号转导以及免疫应答中都具有重要的作用。近年来研究表明, miR-21对固有免疫细胞的生长发育、 分化和免疫应答发挥重要作用, 其中包括在TLRs介导的炎症反应中起到重要的调控作用。本研究利用TargetScan等靶目标预测软件, 对miR-21与TLR4基因的靶向调控关系进行了预测, 并构建了能高效表达成熟miR-21的腺病毒载体, 利用293A细胞包装成的腺病毒感染HeLa细胞, 通过Western blot对TLR4在蛋白表达水平进行了检测, 为进一步研究miR-21生物学功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 质粒小量和pd-pcr扩增 引物由上海生工合成; TRIzol试剂(Invitrogen, 美国), 限制性内切酶(Fermentas、 TaKaRa, 中国);TransLipidTransfection Reagent(全式金公司, 中国); 质粒小量制备试剂盒和DNA纯化回收试剂盒(Axygen, 中国); 兔源TLR4多克隆抗体(博士德公司, 中国); PVDF膜(Millipore, 美国)。E.coliDH5α、 BJ5183, HeLa、 293A细胞, 质粒pAdTrack-CMV及pAdEasy-1由本实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 酶切位点kpni及xbai 以小鼠基因组DNA为模板, PCR扩增pri-miR-21基因, 上下游引物分别为5′-TAGGGGTACCCCTAAACCAACCAGCCAACC-3′、 5′-TATGCTCTAGAGCTCCGGCTTTAACAGGTG-3′, 含酶切位点KpnI及XbaI, 扩增片段599 bp。反应参数94℃ 30 s、 55℃ 30 s、 72℃ 1 min。PCR产物经回收纯化后与载体质粒pAdTrack-CMV双酶切回收, T4 DNA连接酶连接, 转化至DH5α感受态细胞。 1.2.2 bj-adeasy表达 将重组质粒pAdTrack-CMV/pri-miR-21及穿梭载体pAdTrack-CMV分别经PmeI酶切线性化, 电穿孔仪转入含有骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞(BJ-AdEasy), 参数设置为1.8～2.5 KV, 200 Ω, 25 μF。4.5～5.0 ms为正常。Kan(100 μg/mL)抗性LB平板压力筛选。取较小克隆菌落提取质粒,PacI酶切鉴定, 将鉴定阳性质粒, 标记为pAd/pri-miR-21, 对照为pAd/neg。 1.2.3 细胞荧光表达量检测 pAd/pri-miR-21及pAd/neg腺病毒重组质粒经PacI线性化, 酚氯仿抽提、 乙醇沉淀回收并测定其含量与纯度。Trans LipidTransfection Reagent试剂转染293A细胞后(操作按试剂盒说明书进行)培养7～14 d, 观察荧光表达量。当细胞出现特征病变CPE(局部细胞变圆、 脱落, 成网状)细胞状态不足以维持时, 收获病毒。感染293A细胞进行数轮扩增, 以提高病毒滴度。TCID50法测定病毒滴度, 按照如下公式计算(Spearman-Karber Method): 病毒滴度=10(X+0.8)(pfu/mL), X表示: 从10-1到10-11依次稀释度下CPE阳性率孔数, 单个孔阳性记为0.1。 1.2.4 mir-21rt-pcr检测细胞培养 常规培养HeLa及293A细胞分别接种于24孔板, 细胞密度达80%左右加入病毒。用感染复数 (MOI)为1, 10, 30, 50, 70, 100重组腺病毒感染细胞, 培养基设空白对照。24 h后荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数, 连续观察4 d排除野生型病毒后取达100%感染率的MOI值感染HeLa细胞, 提取pAd/pri-miR-21、 pAd/neg病毒感染48 h及正常HeLa细胞微小RNA, 进行成熟miR-21表达的RT-PCR检测, 设计茎环引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCGGCATC-3′, 以其为RT引物将成熟miR-21特异逆转录为cDNA。分别以5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′, 5′-ACACTCCAG