人白细胞介素16重组腺病毒表达载体的构建及鉴定.docxVIP

人白细胞介素16重组腺病毒表达载体的构建及鉴定 16（il-16），也被称为16位红细胞（lcf）过渡因子。基因定位于人15q2.6, 包括7个外显子和6个内含子, 编码相对分子质量 (Mr) 约为80 000。多种细胞能产生IL-16, 包括CD 4+和CD 8+T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和树突状细胞等, 用组胺、CoA、5-羟色胺、GM-CSF、PMA、C 5a作用下, 细胞内合成631个氨基酸残基的IL-16蛋白前体 (pro-IL-16) 。pro-IL-16在胞质内由胱冬氨酸酶 (Caspase-3) 裂解成2个片段:N端片段和C端片段。其中含有121个氨基酸残基的C端片段为IL-16单体。IL-16通过靶细胞表面天然受体CD 4分子发挥生物作用。例如趋化CD 4+细胞, 上调CD 25、IL-4、IL-1β的表达, 抑制病毒复制等多种功能。广泛参与体内免疫调节。 分离正常人PBMC, 组胺刺激后提取总RNA, 采用RT-PCR、分子克隆及基因测定的方法获得IL-16cDNA。进而导入pAdEasy-1腺病毒载体中, Western blot对表达产物进行鉴定。为后续研究其抑制成人T淋巴细胞1型病毒 (HTLV-1) 及成人T淋巴细胞白血病 (ATL) 的发病机制等奠定基础。 1 材料和方法 1.1 pcr检测试验剂 pAdEasy-1腺病毒骨架质粒、含有绿色荧光蛋白标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒购自德国Merck公司。大肠杆菌JM 109及BJ5183由本实验室保存。TaqDNA聚合酶、PmeⅠ及PacⅠ以及脱氧核糖核酸 (DNA) 分子量标准等酶购自TaKaRa公司。核糖核酸 (RNA) 抽提试剂盒购自碧云天生物试剂公司。ECM发光试剂盒购自武汉博士德生物公司。引物合成由上海生物工程有限公司完成。人胚肾细胞HEK293T由本实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 收集pbmcs 抽取健康志愿者外周静脉血 (肝素抗凝25U) , 用等体积的D-Hankapos;s液稀释, 淋巴细胞分离液密度梯度离心后收集PBMCs。用含有100mL/L胎牛血清的RPMI1640调整细胞密度为1.0×106个, 培养于RPMI1640完全培养基 (含100mL/L胎牛血清, 1×10-4mol/L组胺, 100mg/L青霉素及1×104U/L链霉素) 中, 置37℃、50mL/LCO2温箱培养24h后, 1 200r/min离心收集细胞。 1.2.2 rt-pcr扩增 按试剂盒说明书操作提取总RNA, 测定A260和A280比值为1.9。以总RNA作为模板, 并进行RT-PCR。 参考GenBank登录的IL-16cDNA设计引物。上游引物5′-CGCGGA TCCATG CCCGACCTCAACTCC-3′, 下游引物5′-CCA TCG ATCAGCATG TCCTGCCTA GGA G-3′, 其中上游引物引入BamH I酶切位点, 下游引物引入ClaI酶切位点。扩增产物的长度约400bp。GAPDH:上游引物5′-TCC CTC AACATTGTCAGC AA-3′, 下游引物5′-AGC TCC ACA ACG GATACA T-3′, 产物309bp。建立100μL PCR反应体系。PCR扩增反应条件为:预变性95℃, 5min;变性94℃1min;退火55℃1min, 延伸72℃1min。共30个循环, 最后于72℃延伸10min。 1.2.3 基因测序检测 PCR产物经12g/L的琼脂糖凝胶电泳, 凝胶回收试剂盒回收目的基因。将pAdTrack-CMV PacⅠ酶切后, 与胶回收的IL-16片段经T4DNA连接酶16℃过夜连接, 取反应终产物10μL转化JM 109感受态细菌, 卡那霉素抗性的LB培养基平板筛选pAdTrackCMV-IL-16转移质粒的阳性克隆。次日平板上挑取若干个克隆, 于含卡那霉素抗性的LB培养基中震荡培养, 质粒小量抽提试剂盒抽提重组质粒, 经BamH I和ClaI双酶切鉴定, 产物用ABI3130测序仪基因测序。正确的克隆命名为pAdTrack-CMV-IL-16。 1.2.4 生物质粒基因型酶重组菌bj51316e的构建 将测序正确的含有绿色荧光蛋白标记的pAdTrack-CMV-IL-16质粒PmeⅠ酶切线性化后, 与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1电穿孔发共转化BJ5183。挑取若干个克隆, 抽提质粒转化大肠杆菌JM 109, 再提取质粒经琼脂糖电泳, 并进行测序。正确的克隆命名为pAd-IL-16。同时制备空载体腺病毒作为阴性对照。 1.2.5 细胞病变和毒种 从扩增的JM 109菌体中抽提重组腺病毒质粒, 转染70%贴壁的HEK 293T细胞。在荧光显微镜下观察绿