3-甲基-2-苯并噻唑酮法检测饲料中木聚糖酶活性.docxVIP

3-甲基-2-苯并噻唑酮法检测饲料中木聚糖酶活性 木聚糖是植物半养分的主要成分。它是自然界中最好的自然资源，主要成分是d-木糖。虽然木聚糖是一类广泛存在于植物体内的半纤维素, 但是, 由于木聚糖在动物消化道内不能被消化吸收, 并且阻碍其它营养成分的消化利用, 具有很强的抗营养特性, 因而限制了许多饲料的应用。木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶酶系, 可将木聚糖逐次降解为低聚木糖及木糖, 从而消除木聚糖的抗营养作用, 提高动物对饲料的利用率。目前检测木聚糖酶最常用的方法为DNS法, 但此法灵敏度低, 难以满足饲料中微量添加量的检测。3-甲基-2-苯并噻唑酮腙 (MBTH) 法主要用来测定醛的含量, 由于木糖的半缩醛结构具有一定的还原性, MBTH首先与还原糖反应生成嗪, 过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子, 再与嗪反应生成青蓝色化合物, 在一定范围内, 还原糖的量和反应液的颜色强度呈正比例关系。本文根据这一原理检测木聚糖酶的酶活力, 旨在验证该方法的可行性。 1 材料和方法 1.1 试剂的配制 木糖 (sigma) 、木聚糖 (sigma) 、木聚糖酶、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙 (MBTH) 、二硫苏糖醇 (DTT) 、硫酸铁铵、氨基磺酸、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠试剂等。 紫外-可见分光光度计 (Unico UV2800) 、水浴摇床 (常州国华) 、漩涡混合器、电子天平 (精确至0.000 1 g) 、带搅拌的恒温水浴锅 (HH-4, 常州国华) 、移液器、秒表设备等。 1.2 样品 木聚糖酶及饲料样品均采购于市场。 1.3 调节催化剂的配制 50 mM pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液:称取三水乙酸钠5.785 g, 加入冰乙酸0.425 ml, 加水溶解, 定容至1 000 ml。测定溶液pH值, 如果偏离5.50, 再用乙酸或乙酸钠溶液调节至5.50。 MBTH显色液:3 mg/ml的MBTH溶液和1 mg/ml的DTT溶液等量混合即得, 现用现配, 1 d内有效。 硫酸铁铵试剂:准确称量5.000 g硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·12H2O]和5.000 g氨基磺酸, 溶解, 转移至1 000 ml容量瓶中, 加入36%～38%的浓盐酸41.75 ml, 溶解, 定容, 充分混匀, 转移至棕色瓶中, 于4℃冰箱贮藏待用。 1 mg/ml木糖标准溶液:精确称取干燥至恒质量的木糖0.100 1 g, 用缓冲液定容至100 ml, 得1 mg/ml的木糖溶液。 1.4 空白样的制备 分别吸取木糖标准溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml和2.8 ml, 用缓冲液定容至100 ml, 配制成浓度为4、8、12、16、20、24、28μg/ml木糖溶液。 分别取上述各浓度木糖溶液500μl (3组平行样) , 加入到500μl 0.5 M的NaOH溶液中, 再分别加入MBTH试剂500μl, 充分混匀, 80℃水浴加热15 min后, 迅速趁热加入硫酸铁铵试剂1 ml, 室温冷却后在650 nm处测定吸光度值。以相应缓冲溶液代替木糖溶液制成空白样。 以木糖浓度为Y轴, 吸光值为X轴, 得出标准曲线。 1.5 反应与酶溶液的制备 1.5.1 添加配合饲料 除按GB/T 14699.1的规定进行采样外, 对于用喷涂方式添加木聚糖酶的颗粒配合饲料, 应开包将颗粒及粉化的料混匀后, 按四分法缩分至200 g, 并粉碎通过0.45 mm标准筛, 混匀后装入密封容器内备用。 1.5.2 提取工艺的制备 称取0.5 g样品 (颗粒及粉状样品均按1.5.1进行预处理) 于150 ml锥形瓶中, 精确至0.000 1 g, 加入50 ml缓冲液, 在回旋式振荡器上提取30 min。提取后的试样在离心机上以12 000 r/min离心10 min, 取上清液待测。 1.5.3 样品液体反应为酶溶液 液体样品直接用乙酸-乙酸钠缓冲液进行稀释, 定容。 1.6 木糖含量的测定 将经预处理的且37℃预热过的0.5 ml酶液和0.5 ml底物溶液 (0.8 mg/ml) 于试管中混合好后开始计时, 于37℃水浴反应30 min, 加入1 ml 0.5 M的NaOH溶液, 充分混合以终止反应, 再分别加入MBTH试剂1 ml, 充分混匀, 80℃水浴加热15 min后, 迅速趁热加入硫酸铁铵试剂2 ml, 室温冷却后在650 nm处测定吸光度值, 对照标准曲线计算木糖的量。同时以缓冲溶液代替酶溶液检测以作为空白对照。 1.7 返回率测试 精确添加一定量木聚糖酶至已知酶活饲料中, 按1.6检测酶活, 计算回收率。 1.8 吸光度的测定 式中:X——木聚糖酶活性 (U/g) ; AE——酶反应液吸光值; AB——空白对照吸光值; K——