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基质中酶的提取及活力测定方法研究进展 在木聚糖酶的生产、销售和应用等流通链中，酶活力是质量控制的重要指标，其测定方法是确定结果是否正确的关键。根据木聚糖酶的来源及应用, 所存在的基质包括微生物发酵液、饲料、食品添加剂、纸浆等。基质中酶活力受多种因素影响, 如温度、p H、激活剂、抑制剂等。另外, 为提高酶制剂的稳定性, 无活性载体常被用来将酶进行吸附固定, 在检测时如何将酶提取出来也较为关键。其测定方法可按原理不同分为粘度法、琼脂糖扩散法、生色底物法、酶联吸附分析法和目前使用较多的还原糖法等。 1 两种酶的提取 酶的提取质量受提取溶剂、温度、提取时间的影响。同一种酶在不同的基质环境中抽提条件也不同。Cosson等在测饲料中木聚糖酶活力时用p H4.8的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液在室温下搅拌提取0.5h, 离心取上清作为酶提取液。高玲等研究浙江酶、华芬酶、Avizyme-1500三种酶制剂中木聚糖酶的提取, 发现华芬酶、Avizyme-150中最佳抽提条件为0.1mol/L的氯化钠溶液4℃抽提12h, 而浙江酶是蒸馏水4℃提取12h。苏玉春等采用双水相法从黑曲霉的发酵液中提取木聚糖酶, 即选用PEG4000提取体系, 其质量分数为19%, 磷酸氢二钾质量分数为10%, 氯化钠浓度为0, 亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相后, 酶在两相中分配不同, 来达到提纯目的。 2 酶提取物的生命力由氨基酸中的酶提取决定 2.1 底物粘度的测定 该法是通过测木聚糖酶对底物粘度的降解率来衡量酶的活性高低, 以阿拉伯木聚糖, 水溶性木聚糖衍生物等作为底物。底物粘度可通过测流量的粘度计以及振动旋转粘度计等现代电子设备, 引起的电阻变化被转化为酶活力单位。虽然粘度法比较灵敏, 但操作复杂繁琐, 重复性差, 不能测定底物的米氏常数, 不常使用。 2.2 木聚糖酶活力测定 该法的理论基础是刚果红与多糖的显色反应。将木聚糖和琼脂混合制成凝胶板, 在琼脂板上切开一条凿, 将酶溶液倒入到凿内与底物在适当条件下发生酶水解, 水解一段时间后通过直接测定水解区域的直径来反映酶活力的大小。饲料本身还原糖不与刚果红发生反应, 因此有报道将其运用于饲料中木聚糖酶的活力测定。该法操作简单, 虽不受饲料本身还原糖的干扰, 但培养时间长, 对透明圈的分析较为复杂, 准确性低于其他非扩散法。 2.3 水解反应对木聚糖酶活力的影响 该法是将生物素基-木聚糖底物包被在酶标板上, 加入木聚糖酶在一定温度条件下酶解后, 洗掉已降解的木聚糖, 用碱性磷酸酶抗生蛋白链菌素偶联于酶标板上未被降解的生物素基-木聚糖上, 然后, 加入碱性磷酸酶的底物 (对硝基苯磷酸酯) 进行显色反应, 根据显色的深浅来定量未被降解的木聚糖的量, 由此间接地测定木聚糖酶的活力。该法操作简单, 成本低, 不会因底物中含有过多还原糖而影响测定结果, 但是如何针对该方法提取样品 (消化道食糜和饲料) 中的酶以及如何消除样品中的内源底物的干扰等仍有待于解决。 2.4 合成芳基类物 该法是对底物进行化学修饰后使其带有特定的荧光物质或染料, 在木聚糖酶催化下释放染料或荧光物质, 通过释放于乙醇中的染料或荧光物质的多少来反映酶活的大小。可用的染料有雷马氏亮蓝 (Retnazolbrilliant Blue R, RBB) 、刚果红等, 荧光材料有2- (2-苯丙噻唑) 酚 (2- (2-benzothiazolyl) -phenyl) 、4-甲基伞形酮 (4-methylumbelliferyl) 、荧光增白剂 (Calcofluor) 等。目前文献报道合成一种较好的荧光底物6, 8-difluoro-4-methyl-umbelliferylβ-D-xylobioside (Di FMUX2) , 找到了内切-β-1, 4-木聚糖酶的最佳染色底物为芳基4-硫-β-木糖甘。该类方法操作简单, 但由于底物制备的特殊性, 提高了测定成本, 且该法对温度、离子强度、乙醇浓度及影响染色片段溶解度的因素非常敏感。另外, 饲料酶作用的底物是酶的天然底物, 不宜采用该法测活力。 2.5 还原糖法 该法是利用木聚糖经酶促水解产生的还原端基被氧化所产生产物的量来计算酶活力, 包括DNS法、MBTH法等。 2.5.1 比色法测定还原糖和反应液的颜色强度法 该法是利用3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) 在碱性条件下与木聚糖酶解产物的还原末端反应生成橙黄-棕红色的氨基化合物, 在一定范围内, 还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系, 利用比色法测定还原糖的量来表示酶活力。该法是目前最常采用的方法之一, 所得产物颜色稳定性好, 操作简单, 蛋白质对测定无干扰, 且测定精密度高。但该法的灵敏度较低, 特别是对于Km值较大的酶活力测定情况很难测得酶解初速