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动物蛋白质提取的研究进展 蛋白质是生物有机质的重要组成部分，是生命的基础之一。随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的深入和对蛋白质功能、生物活性认识的提高,许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质。研究动物蛋白质的结构和功能,首先要得到高纯度的具有生物活性的目的蛋白,高效的纯化技术和手段是研究动物蛋白质的重要基础和关键之一。 1 细胞提取溶剂 提取动物组织蛋白质要先经过清洗、烘干、粉碎等处理。为了尽可能地提取完全,常需破碎动物组织的细胞,释放蛋白质进入提取溶剂中。为避免活性蛋白变性失活,在细胞破碎过程中应注意控制条件。 1.1 动物组织的细胞破裂 实验室内常用的细胞破碎方法有物理、化学及生物化学方法。 1.1.1 肌球蛋白的提取 机械方法主要通过机械切力破坏组织细胞,常用的有高速珠磨法和匀浆法。朱彬等在提取心肌肌球蛋白的研究中,以成年白兔心脏为原料,用匀浆法破碎去除了脂肪及结缔组织的兔左心室细胞,制得的匀浆液经磁力搅拌、离心等步骤得到心肌肌球蛋白粗品。提取的肌球蛋白产率和纯度均较高。 非机械方法通过各种物理因素破碎组织细胞,常用的有冻融法和超声波法等。李敏康等根据纤维蛋白原在低温下可形成絮状沉淀的性质,用冻融法从猪血中提取纤维蛋白原。以纤维蛋白原中可凝固纤维蛋白含量及纤维蛋白原得率为指标,考察了冷冻、解冻等因素对提取纤维蛋白原的影响,确定最佳提取条件为:抗凝血浆-20℃冷冻12 h,经4℃解冻后低温离心收集纤维蛋白原样品。超声波破碎在实验室规模应用较普遍,处理少量样品时操作简便,液量损失少。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感活性物质变性失活,处理一些超声波敏感的蛋白酶时宜慎重。张富新应用超声波提取羔羊凝乳酶,大大缩短了提取时间,且对羔羊凝乳酶有一定的激活作用。 1.1.2 细胞内释放法 有机溶媒法是将材料置于低温下,加入适量的有机溶剂迅速搅拌破碎细胞膜,破坏蛋白质与脂质的结合。自溶法是在适当p H和温度下,利用自身的蛋白酶破坏细胞,使细胞内含物释放。但自溶时间较长,不易控制,所以制备活性蛋白质时较少用。 1.1.3 有效部位的提取 酶解法操作条件温和,专一性强,收率高,选择合适的酶和反应条件,即可有效地提取蛋白质,在食品工业、海洋生物制药和药物有效部位提取方面已显示出较好的应用前景。钱曼等用酶解法从草鱼鱼鳞中提取胶原蛋白,以鱼鳞胶原蛋白水解度为考察指标,确定的最佳提取工艺为:加酶量0.14 m L,60℃水解4 h,料液比1∶20,胶原蛋白的水解度为6.43%。经比较认为酶解法提取的胶原蛋白的黏度、吸水性和起泡性大于热力法提取的,但保水性、乳化能力和乳化稳定性及泡沫稳定性小于热力法。 1.2 动物组织的蛋白质溶剂 大部分动物组织蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂。 1.2.1 蛋白质的提取 提取动物组织蛋白质一般采用各种水溶液。稀盐和缓冲体系的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是最常用的溶剂。稀盐溶液(一般用Na Cl溶液)可促进动物蛋白质溶解,同时因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点。鲁晓翔等用单因素试验法,研究了用低盐溶液提取蚂蚁蛋白的条件。缓冲液常用0.02~0.05 mol/L磷酸、碳酸以及Tris-HCl等。刘高强等用缓冲液法研究了马尾松毛虫幼虫中蛋白质的提取,认为用方法可行且提取效果优于稀碱法,总氮提取率更高,实验确定的最佳条件为:缓冲液为N a 2HPO4-Na OH(p H 9.5),料液比1∶15(m/v),原料粗细度为40目虫粉,抽提时间5 h,抽提温度40℃,沉淀p H 5.0,沉淀温度5℃,沉淀时间1 h。此条件下所得蛋白质产品的粗蛋白含量为(71.12±0.16)%,总氮提取率为(60.36±1.25)%。蛋白质是具有等电点的两性电解质,提取液的p H值应偏离等电点。一般来说,碱性蛋白质用偏酸性提取液,酸性蛋白质用偏碱性提取液。陈申如等用酸法溶解提取鲢鱼中鱼肉蛋白质,蛋白质产率达90%左右。 1.2.2 蛋白质提取工艺 一些蛋白质和酶与脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多,不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取。它们具有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取脂蛋白质的溶剂,但必须低温操作。李万忠等用乙醇回流提取法提取全蝎、蜈蚣蛋白质,以醇浸膏得率及总氮含量为检测指标,优化醇提工艺条件为:4倍量、3倍量60%乙醇回流提取2次,时间分别为1.0,0.5 h。 有时单纯用一种溶剂很难全面地提取材料中的蛋白质,可采用几种溶剂依次提取,从而得到不同类型的蛋白质。李爽等分别用磷酸缓冲液、醋酸溶液、氢氧化钠溶液、乙醇溶液提取蜂王幼虫的蛋白质,并优化了提取工艺。 2 动物组织的蛋白质分离 2