蛇足石杉内生真菌培养培养基选择.docx

蛇足石杉内生真菌培养培养基选择 （对不同外植体培养，以期得到最多内生真菌内生真菌分离） 目的：1不同内生菌对培养基的选择生长，配制不同成分培养基加额外营养成分，2不同部位生长的内生菌不同，选取不同部位培养，获得最大菌种数 依文献资料，茎里最多，最终希望获得植株体内所有内生真菌种类1）制备3种培养基，121r，20min高压灭菌 b:PDA（内生真菌） 成分：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15-20g,无菌水1000ml 马铃薯切块煮沸，再用纱布过滤，后加葡萄糖及琼脂，溶化后补水至1000ml c：MS（植物组培） 取41.74g溶于1000ml水中2）将消毒后的外植体接入到不同培养基中，观察其菌落情况，记录3）设置对照 a:不做消毒的外植体接入培养 b:最后一次淋洗的无菌水取0.1ml涂布于培养基上 c:空白对照4）纯化分离：用接种针挑取菌株尖端菌丝，用三点接种法接种于培养基的适当位置，使成三角形的3个点，倒置于恒温培养箱中30r下培养，如此重复3次，直到长出的菌落形态特征一致，形成纯化菌落，甘油中菌种保藏5）内生真菌鉴定重要 步骤:不同外植体经第1次灭菌后接种于MS培养基中,一周后进行第2次灭菌，并切割成0.5?1.0cm长度培养。二次灭菌的另一组材料不做切割，直接在同等条件下培养. 根据第2次灭菌未切割外植体的表面无任何菌长出，仅是第1次灭菌前的老切口偶尔有菌丝长出，证明第2次灭菌后新切口处长出的菌丝是内生菌。 6)a真菌菌种鉴定： 点植培养法(观察菌落及常规镜检):用接种针从斜面上蘸极少量孢子，点植于平板上适当的位置，使成三角形的3点，倒置放于恒温箱中30°C下培养观察菌落特征。接种针从菌落边缘处挑取少量菌丝,,进行常规镜检。 载片培养观察法(观察孢子及菌丝体形态):将培养基琼脂薄置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，真菌即在载玻片与盖玻片之间有限的空间内沿盖玻片横向生长。培养一段时间后，将载玻片置于显微镜下观察。 打片法(观察基内、气生菌丝):将真菌接种到平板上，打上灭菌盖玻片后培养，使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接观察。 培养条件：30度，避光培养