小生境范围内3种园林植物叶际细菌群落结构及多样性分析.docxVIP

? ? 小生境范围内3种园林植物叶际细菌群落结构及多样性分析 ? ? 白农恩，刘李蕾，邓 巍，姜 林，杨晓燕 （大理大学东喜玛拉雅研究院/云南省高校洱海流域保护与可持续发展研究重点实验室/三江并流区域生物多样性保护与利用云南省创新团队/中国三江并流区域生物多样性协同创新中心，云南 大理 671003） 【研究意义】叶际是指整个植物地上部分的外表面，生存在叶际表面的微生物称叶际微生物［1-3］。叶际作为一个独特的微生境，富含丰富的微生物类群，包括真菌、细菌、病毒和原生动物等［4-5］。已有研究表明，叶际微生物能够帮助植物对抗病原微生物、耐受逆境（干旱、紫外线、霜冻等）、促进营养吸收，以及调节植物代谢平衡等［6］，而叶际微生物除对植物有积极影响外，也会对植物产生许多负面作用，如病原菌的积累会使植物发病［7］。因此，了解叶际微生物群落结构及其形成机制对植物健康管理和微生物资源开发具有重要意义。 【前人研究进展】叶际微生物的研究起步较晚，研究的广度和深度不如根际微生物，但叶际微生物对于植物的健康生长发育同等重要。目前根际微生物在植物健康方面的研究已经相对成熟，但对叶际微生物的研究仍然停留在探索初期［8-11］。这不仅阻碍了对植物与叶际微生物互作关系的认知，也限制了叶际微生物资源的开发与应用。细菌是自然环境中最主要的微生物类群之一，已有研究表明，植物和叶际微生物之间互相影响，双方处在一个动态平衡的过程中。相对于根际部分，叶际部分所占植物个体的比例较根际大得多，因此对于叶际微生物的研究，既有挑战也有机遇。随着叶际微生物功能（如改变宿主微环境、防御病害、生物固氮、促进植物生长等）的不断发掘，叶际细菌正逐渐被人们所关注［12-13］。 【本研究切入点】在同一小生境条件下，植物种类差异以及植物与微生物间的相互作用对叶际微生物细菌群落的影响均较大。植物自身特性对细菌群落的影响不仅反映了植物与微生物间的相互作用，还能直接反映植物的健康状况，能够为园林植物的健康管理提供具体指导。在小生境下对不同植物的叶际微生物多样性、群落组成差异等进行比较，探究叶片微生境差异对叶际细菌群落组成的影响，是亟需解决的科学问题。【拟解决的关键问题】本研究以云南省大理市大理大学古城校区一小生境为研究区域，选择我国西南片区最常见的3 种园林乔木为研究对象，使用Illumina 高通量测序技术对大理大学古城校区50 m 半径圆内统一朝向东边栽种的3 种园林植物（枇杷树Eriobotyra japonica、广玉兰Magnolia grandif lora和大青树Ficus altissima）不同大小叶片上的叶际细菌多样性和群落结构进行比较分析。该研究区域土壤为棕壤，年平均气温为14.9 ℃，年日照时数2 227.5 h，无霜期227 d，年平均降水量1 051.1 mm，属高原地方性气候，四季温差不大，干湿季分明，校园内环境条件基本一致，能够满足本研究对小生境的需求。3 种园林植物中，大青树属于落叶阔叶植物，而广玉兰和枇杷树属于常绿阔叶植物。大青树叶片双面光滑富含蜡质，幼嫩部分稍被毛。广玉兰叶面蜡质最多，叶片背面有短绒毛。枇杷树叶面有褶皱，还有一层蜡质，且双面被毛。这3 种植物自身显著的特性将塑造不同的叶际微生境，为本研究提供了很好的分析基础。而本研究使用的高通量测序技术能够高灵敏度、高效、准确、无偏向性、全面分析叶际细菌的多样性［14-16］，是目前微生物生态学研究首选的技术之一［17-18］。综上，本研究所选择的研究对象、研究区域和试验技术均为小生境下3 种园林植物叶际细菌群落结构及多样性解析提供了保障。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品采集 2021 年3 月6 日，以大理大学古城校区（25° 40 19 N、100° 9 17 E）为研究区域，选择以研究区域内最大的1棵大青树为中心，在其50 m 半径圆内朝向东边再选择1 棵广玉兰和1 棵枇杷树，按叶片长度大小（小：5～10 cm；中：10～15 cm，大：约15 cm）进行树叶样品采集。使用无菌剪刀和镊子分别采集3 种植物不同大小叶片各3 份，共采集27 份样品，即大青树3 片大叶子dl1、dl2、dl3，3 片中叶子dm1、dm2、dm3 和3 片小叶子ds1、ds2、ds3；广玉兰3 片大叶子gl1、gl2、gl3，3 片中叶子gm1、gm2、gm3 和3 片小叶子gs1、gs2、gs3；枇杷树3 片大叶子pl1、pl2、pl3，3 片中叶子pm1、pm2、pm3 和3 片小叶子ps1、ps2、ps3。将叶片置于一次性自封袋中，贴上标签后立即送至实验室对样品进行处理。 1.1.2 样品预处理 向装有样品的自封袋中加入25 mL PBS 缓冲液（pH=8），超声洗涤1 min，涡旋10 s