尼古丁降解菌的分离鉴定和初步特性研究.docxVIP

? ? 尼古丁降解菌的分离鉴定和初步特性研究 ? ? 江吉红，商弘颖，吴立飞，陈连升，马 云 （浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032） 尼古丁降解菌的分离鉴定和初步特性研究 江吉红，商弘颖，吴立飞，陈连升，马 云 （浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032） 从浙江省某农药厂的活性污泥中分离得到一株尼古丁高效降解细菌，根据表型特征、生理生化特性和16S r DNA序列系统发育分析，将其鉴定为假单胞菌属，命名为TW5.该菌株能以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长，当接种量为5%时，菌株TW5在含500 mg／L尼古丁的基础盐液体培养基中降解尼古丁，12 h后降解率约为100%.该菌株降解尼古丁的最适pH为6.5～7.0，最适温度为30℃.研究表明，该菌株具有很强的尼古丁降解能力，可用于处理含尼古丁废弃物. 尼古丁；降解；生物特性；假单胞菌 尼古丁（nicotine），俗称烟碱，分子式为C10H14N2，是多种烟草中所特有的、最重要的生物碱，占烟草重量的1%～2%，是影响烟叶品质的重要因素之一，同时也是烟叶和卷烟的主要有害成分之一. 尼古丁是一种精神药品，人类长期保持着吸食烟草的习惯.然而，尼古丁是烟叶和烟气中主要致癌成分N-亚硝胺（TSNA）的重要前体物［1］，过量吸入会抑制人体中枢神经，麻痹心脏，严重者会有致命的危险［2］；尼古丁也是一种环境有毒物质，在常温下，纯净的尼古丁是无色或淡黄色、味苦、有强烈刺激性的透明的油状液体，在空气中极易被氧化成暗灰色.烟气环境中就含有大量的尼古丁，目前在我国的烟叶中尤其是在上部烟叶中尼古丁的含量普遍过高，这给烟叶的安全生产带来很大的挑战.同时，烟草在加工过程中会产生大量的高浓度尼古丁废料，这种废料被认为是“有毒的危险废物”［3］，若直接排放到环境中，则对环境造成很大的危害.因此使得不断控制和降低卷烟尼古丁含量成为国际烟草业发展的必然趋势，同时也是降低吸烟危害的重要途径之一，这对于维护人类健康有着深远的意义. 较之物理、化学的方法去除烤烟中的尼古丁，微生物法具有操作简单、易改造等独特的优势，越来越受到人们的关注.早在20世纪40年代，就已经有关于微生物降解尼古丁的报道.目前国内外的研究者已经分离得到多株尼古丁降解菌，主要有：假单胞菌属［4－7］、节 杆 菌 属［8］、纤 维 单 胞 菌 属［9］、苍 白 杆 菌属［10］、芽孢杆菌属［11］等.这些微生物多数能利用尼古丁为唯一碳源、氮源和能源进行生长，它们主要通过吡啶途径［8－12］、吡咯途径［13－14］、脱甲基化途径［15－16］将尼古丁转化为羧酸和氨基酸，为微生物的生长提供碳源、氮源和能源，从而达到降解有毒废物的目的. 本研究中从杭州农药厂分离筛选得到一株尼古丁高效降解菌，通过对其进行菌种鉴定和降解特性的研究，发现该菌株可能存在全新的降解途径，这为更全方面的了解尼古丁的降解途径提供了依据，也为构建具有更高降解效率和能耐受更高尼古丁浓度的工程菌建立了基础. 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 富集用的活性污泥采自杭州农药厂. 基础 盐 培 养 基 （MM）：NH4NO31.0 g／L，K2HPO41.5 g／L，KH2PO40.5 g／L，MgSO40.2 g／L，NaCl 1.0 g／L，加入自行配置的微量元素溶液1 mL，pH 7.0. 基础盐固体培养基：基础盐培养基中加入1.5%～2%的琼脂粉. LB培养基：蛋白胨10.0 g／L，酵母膏5.0 g／L，NaCl 10.0 g／L. 固体LB培养基：LB培养基中加入1.5%～2%的琼脂粉. 以上培养基与缓冲液均经过高压蒸汽灭菌（121℃，25 min）. 尼古丁原药购自伊普瑞斯（纯度为99%），使用前将尼古丁原药溶于无菌水中，按所需浓度添加到培养基中. 抗生素购自上海捷倍思公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成. 1.2 试验方法 1.2.1 尼古丁降解菌的分离与纯化 取上述活性污泥5 g放于100 mL的基础盐培养基中，其中基础盐培养基中尼古丁的质量浓度为500 mg／L，30℃，150 r／min摇床培养7 d后，以5%接种量转接至新的含尼古丁的基础盐培养基中，连续富集、转接5次，尼古丁的浓度逐渐提高到1 000 mg／L.取富集后的培养液经梯度稀释后（10－3，10－4，10－5，10－6）涂布于含1 000 mg／L的尼古丁基础盐固体培养基平板上，30℃培养.待平板上出现单菌落后，挑取单菌落划线于LB固体培养基中，反复划线进行纯化，将纯化后的菌落接种至LB固体斜面培养基中保存. 1.2.2 菌种的鉴定 16S r DNA序列和系统发育分析：采用细菌16S r DNA的通用引物（上海英骏生物技术有限公司合成），其正向引物序列：5