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维生素e和维生素c联合染毒对慢性镉中毒小鼠黑质神经元的保护作用 镉（cd）是一种含毒性重金属，在动物体内的半衰期为10-30年。这是已知的最接近身体的有毒物质。镉在工业上用途广泛,随着工业生产的发展,可通过废水、废气、废渣排放到环境中,经被污染的食物、饮用水等多种途径进入人体,对多系统器官造成损害。镉引起的人群慢性镉中毒已经成为一个受到广泛关注的环境健康问题。有研究报道,镉可通过受污染的土壤侵入至稻米中,抽样调查结果显示,中国多地市场上约10%大米镉含量超标。由于我国65%的人口以稻米为主食,因此,在未来的中国农产品安全问题中,重金属污染将取代农药,成为主要的公共卫生问题。贵州是铅、锌矿蕴藏量较为丰富的地区,同时分布着大量的镉,地质分布上列为镉分布区(CP区,包括黔西南和黔西大部分地区)。1985年,柯长茂报道贵州省赫章县天然存在一镉中毒病区,其镉负荷背景与20世纪70年代日本报道的神通川流域“痛痛病”病区的水平相似。近期的流行病学调查显示,该地区20年来镉污染一直存在,且镉的累积水平较高,食物中镉含量高出对照区15倍,尿镉高出对照区8倍。表明赫章县仍是镉污染的重灾区,当地居民的身体健康受到镉污染的严重威胁。近年来的研究发现,镉对神经系统也有明显的毒性作用,不少学者认为,镉可能通过自由基促进细胞脂质过氧化作用,使细胞膜的功能和结构受到损害。笔者的前期研究也表明,慢性镉中毒可致小鼠中脑黑质受损,并提示镉可能是诱发帕金森病的病因之一。维生素E(VE)和维生素C(VC)是一种有效的抗氧化剂,国内外许多资料已证明VE和VC可保护神经组织免受镉引起的自由基增多和氧化反应异常所造成的损害;但是有关形态学方面的研究甚少。本实验研究了VE和VC联合染毒对慢性镉中毒小鼠黑质神经元的保护作用及其形态学改变,为临床防治慢性镉中毒提供实验及形态学依据,对于正确认识和解决镉污染及其引起的地方病及食物安全问题具有重要的社会意义。 1 材料和方法 1.1 药物、试剂、培养基 氯化镉(Cd Cl2,分析纯,北京57601化工厂,批号,维生素E胶囊(纯度99%,广州白云山制药总厂,批号:,维生素C注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号:,酪氨酸羟化酶抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号:BA1454)。 氯化镉染毒溶液的配制:准确称取适量的氯化镉溶解于双蒸水中,配制成相应浓度的氯化镉溶液。 1.2 实验动物的分组 选择健康3月龄清洁级雄性昆明小鼠125只,体重为25~35 g,由贵阳医学院实验动物中心提供,动物合格证号为SCXX[(黔)2002-0001]。实验室温度为(18±2)℃,相对湿度为48%~60%。实验期间,给予标准颗粒饲料及蒸馏水喂养,小鼠可自由摄食、饮水。 将实验动物按体重随机分为5组,分别为正常对照(生理盐水)组、镉中毒(以2 mg/kg氯化镉溶液经皮下注射染毒,染毒容量为5 ml/kg,每周2次)组、镉中毒+VE(以10 mg/kg VE溶液经口灌胃染毒,染毒容量为10 ml/kg,每天1次)组、镉中毒+VC(以25 mg/kg VC溶液经口灌胃染毒,染毒容量为15 ml/kg,每天1次)组、镉中毒+VE+VC组,每组25只。连续染毒3个月。每周称重小鼠体重,观察一般情况。 1.3 观察方法th 取整个中脑,用Bouin液进一步固定,石蜡包埋、切片,分别进行HE染色、尼氏法染色和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化ABC法染色,在光镜下进行观察。其中,TH免疫组化染色的切片采用Biomias99图像分析系统(四川大学图像图形研究所),在10×40倍的视野下测量TH阳性反应神经元的二维形态参数(面积、周长、最大直径、等效圆直径、平均光密度);进一步运用体视学的方法计算出三维形态参数(体密度、数密度、平均截面积、平均体积、圆球度)。 每组随机取3只小鼠脑组织黑质区域1 mm3大小组织块,按常规方法制作切片,在电镜下进行观察。 1.4 方差分析方法 实验数据均以ue0af±s进行表示。采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)。进一步进行组间两两比较时,若方差齐时,采用SNK检验(Student-Newman-Keuls法);若方差不齐时,采用Games-Howell检验。以P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 大学生努力及体重检测 正常对照组小鼠活动度大,饮食正常。镉中毒组小鼠染毒2周后出现活动减少,行动迟缓,无精打采,饮食量下降等情况;少数小鼠步态不稳,且有两只小鼠出现向一侧定向旋转的现象。镉中毒+VE组小鼠活动未见明显减少,饮食正常。镉中毒+VC组小鼠活动未见明显减少,饮食量稍有下降。镉中毒+VE+V