sevag法去除当归粗多糖中的蛋白质.docxVIP

sevag法去除当归粗多糖中的蛋白质 当归糖是一门从后方植物当归糖（oliv.）根提取的糖成分。这些糖含量约为原干燥药物的85%。它调节了生命力，影响了造粒系统，肿瘤和抗辐射。为确切了解当归多糖结构与功能的关系, 先要获得提纯的多糖。去除多糖中的蛋白质是当归多糖精制过程中的重要一步。目前除多糖中蛋白质的常用方法有Sevag法、三氯醋酸法、蛋白酶法、透析法和732树脂法等。杨铁虹报道用反复冻融法除当归粗多糖中蛋白质效果较好, 但未见详细报道。本研究通过单因素试验方法建立了Sevag法去除当归粗多糖中蛋白质的最佳条件, 并与反复冻融法相比较, 为大规模提纯当归多糖提供参考。 1 仪器、仪器和仪器 当归多糖粗提取物 (多糖含量75.8%) 购于山东旺圣药业股份有限公司。 无水乙醇、丙酮、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇均为国产分析纯。 离心机 (AnkeTDL-40B, 上海安亭科学仪器厂) , 紫外可见分光光度计 (UV-mini 1240, 日本岛津公司) , 试管混匀器 (SK-1天津华北实验仪器有限公司) , 分析天平 (FA 2004, 上海精科天平有限公司) , 冷冻干燥机 (FD-1A-50, 北京博医康实验仪器有限公司) , 磁力搅拌器 (HJ-4A, 天津市华北实验仪器有限公司) 。 2 方法 2.1 无水乙醇醇沉法 当归粗多糖溶于水, 4 000r/min离心10min去除杂质, 上清加2倍体积的无水乙醇醇沉。离心后沉淀用无水乙醇和丙酮反复洗涤至上清液无色, 沉淀冻干后配成的多糖溶液备用 2.2 机械研磨法21,51,61和61 氯仿与正丁醇体积比设以下5个梯度, 即2∶1, 3∶1, 4∶1, 5∶1和6∶1。Sevag试剂与当归粗多糖溶液按1∶3混合, 搅拌30min后, 4 000r/min离心10min, 取上层糖溶液测多糖和蛋白质含量。 2.3 监狱警察的职责分类 多糖溶液与Sevag试剂的体积比分别为1∶1, 2∶1, 3∶1, 4∶1和5∶1。搅拌30min后4 000r/min离心10min, 取上层糖溶液测多糖和蛋白质含量。 2.4 研究对象 多糖溶液与Sevag试剂的搅拌时间分别设为10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50min。搅拌结束后4 000r/min离心10min, 测上层糖溶液中多糖和蛋白质含量。 2.5 冷冻溶液的制备 将多糖溶液置-20℃冰箱冷冻后, 室温溶解, 4 000r/min离心10min, 再冷冻, 再溶解。每次溶解、离心后测上层糖溶液中的多糖和蛋白质含量。 2.6 sevag法与反复冷冻法的除蛋白质作用的比较 找出Sevag法除蛋白质的最适条件后, 与反复冻融法比较, 以确定除蛋白质的最佳方法和次数。 2.7 测量和指标 2.7.1 多糖损失率 多糖含量用苯酚-硫酸法测定, 用分析纯葡萄糖做标准曲线。多糖损失率 (%) =100× (M1-M2) ÷M1。M1:去除蛋白质前溶液中多糖的含量;M2:去除蛋白质后溶液中多糖的含量。 2.7.2 蛋白质去除率及蛋白前溶液蛋白含量的测定 蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定, 用牛血清白蛋白做标准曲线。蛋白质去除率 (%) =100× (N1-N2) ÷N1。N1:去除蛋白质前溶液中蛋白质的含量;N2:去除蛋白质后溶液中蛋白质的含量。 2.8 dunpan多重比较 所得数据用SPSS16.0统计软件做单因素方差分析, 差异显著的 (P0.05) 用Duncan法做多重比较。表中数据用x±s表示, n=3。 3 结果 3.1 蛋白质去除率和多糖损失率 不同比例的氯仿与正丁醇与多糖溶液混合后, 搅拌30min, 测得的蛋白质去除率和多糖损失率见表1。由表1得知, 当氯仿与正丁醇比例为4∶1时, 蛋白质去除率最高, 多糖损失率最低。因此氯仿与正丁醇的最适比例为4∶1。 3.2 蛋白质去除率和多糖损失率的测定 氯仿与正丁醇按4∶1配成的Sevag试剂与当归粗多糖溶液按不同比例混合, 磁力搅拌器搅拌30min后, 测蛋白质去除率和多糖损失率。结果见表结果表明粗多糖溶液与试剂按和混合, 蛋白质去除率均较高且二者间差异不显著, 但3∶1时的多糖损失率显著低于4∶1, 因此粗多糖溶液与Sevag试剂的最适比例为3∶1。 3.3 混合过程中蛋白质去除率和多糖损失率的测定 当归粗多糖溶液与Sevag试剂 (氯仿∶正丁醇=4∶1) 按3∶1混合, 搅拌不同时间后测蛋白质去除率和多糖损失率, 结果见表3。搅拌时间在20～45min时蛋白质去除率均高于70%且差异不显著。多糖损失率随搅拌时间的延长而显著升高。因此搅拌时间为35min时最佳。 3.4 反复冻融法与sevag法不同处理次数下多糖去除率 在Sevag法除蛋白质的最适条件下除