骨组织成骨细胞特异性基因mrna及蛋白表达在糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型中的表达及中药的调控作用.docxVIP

骨组织成骨细胞特异性基因mrna及蛋白表达在糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型中的表达及中药的调控作用 由于糖皮质激素（tc）的广泛生理和药理作用，深受临床应用。然而，过量的tc可能会带来许多严重的副作用，主要是由于骨骼的影响和骨质疏松症，即糖皮质激素性骨质疏松症。GIOP是最常见的继发性骨质疏松症,其发病率仅次于绝经后和老年性骨质疏松症而居第3位,其发病机制和防治研究引起研究者的普遍重视。本研究以成骨细胞特异基因(osterix,Osx)为效应指标,探讨GIOP大鼠模型骨组织Osterix m RNA及蛋白表达变化,并比较补肾、健脾、活血中药的疗效及其调控作用。 材料和方法 1. 动物 2. 模型的建立和组成 2.1 卓峰合成饲料小虾粉 实验开始后,除正常组外,其余大鼠左后肢肌肉注射地塞米松磷酸钠注射液(规格:1m L:5mg,郑州卓峰制药厂,批号:国药准字,剂量为2.5mg/kg体质量,每周2次,连续9周,喂以低钙饲料(配方:玉米面45%,白面30%,麸子7.5%,豆饼15%,酵母0.5%,鸡蛋1%及豆油1%)。正常组大鼠,喂以全价颗粒饲料,常规饲养9周。全部大鼠同室饲养,自由饮食,环境同前。 2.2 动物组 3. 本研究中的因素、剂量和方法 3.1 中草药及功效 健脾法及健脾中成药:补中益气颗粒(方药组成:炙黄芪、党参、炙甘草、当归、炒白术、升麻、柴胡、陈皮、生姜、大枣,北京汉典制药有限公司,批号:090101)。功效:补中益气。 活血法及活血中成药:血府逐瘀胶囊(方药组成:炒桃仁、当归、麸炒枳壳、川芎、柴胡、红花、牛膝、赤芍、地黄、桔梗、甘草,天津宏仁堂药业有限公司,批号:国药准字。功效:活血祛瘀。 阳性对照药:骨疏康颗粒(方药组成:淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜子,辽宁康辰药业有限公司,批号:国药准字。功效:补肾益气、活血壮骨。 3.2 给药剂量和方法 3.2.1 给药剂量及给药剂量 大鼠等效剂量按成人每日用药量的6.3倍计算(成人体质量按60kg计算),容积为1m L/100g体质量。A组、B组给予等体积的生理盐水;C组给药量为1.139g·kg-1·d-1(鹿茸:0.8g·kg-1·d-1,淫羊藿提取物:0.076g·kg-1·d-1,牡蛎:0.263 g·kg-1·d-1);D组给药量为0.945g·kg-1·d-1;E组给药量为0.504g·kg-1·d-1;F组给药量为2.1g·kg-1·d-1。 3.2.2 给药方法 4. 样品的采集和准备 5. 检测方法的确定 目前国内外主要是通过检测骨密度来诊断骨质疏松,最常用的检测方法是双能X射线吸收测量法(DEXA)。笔者应用XR-26型双能X线骨密度仪测定大鼠离体股骨骨密度来评价骨质疏松症大鼠模型复制是否成功。 6. 指标的检测和方法 6.1 大腿骨密度bsd的测量 6.2 骨组织osteris的mrna和蛋白质表达 6.2.1 rt-pcr检测mrna表达水平,方法 Trizol法提取大鼠股骨头总RNA,分光光度法测260nm与280nm的OD值,用OD260/OD280估计RNA纯度,约在2.0左右,提示为RNA纯品。按SYBROR Prime Script TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(Ta Ka Ra大连宝生物公司)说明进行反转录和Real-Time Quantitative PCR扩增。主要仪器:ABI 7500型定量PCR仪(美国)。检测方法:SYBR GreenⅠ嵌合荧光法。引物设计与合成:先在Gene Bank中查找目标基因的全序列,然后使用Primer 5.0软件设计引物(引物序列见表1),由北京华大基因公司合成引物。结果:Real-Time Quantitative RT-PCR数据收集由7000System SDS Software自带软件完成,通过软件计算所有样品的C值,以β-actin作为内参照基因进行校准,采用2-△△Ct(Livak)方法对目标基因(Osterix)的m RNA表达进行相对定量。公式:△Ct=Ct(target)-Ct(ref);Avg.△Ct(calibrator)=Avg.C(target,calibrator)-Avg.Ct(ref,calibrator);△△Ct=△Ct-Avg△Ct(calibrator);2-△△Ct表示通过参照基因校准的目标基因(Osterix)m RNA的相对表达水平。 6.2.2 主要试剂与检测方法 细胞裂解法提取大鼠股骨头总蛋白,Lowry法蛋白定量,SDS凝胶电泳,Western Blot蛋白质印迹。主要仪器:电泳仪(美国BIO-RAD,Power Pac200)。主要