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大花珊和国兰粉活性测定方法的比较 大花喜兰是优良的品种，以兰花科或木兰科的一些大型花种为父本，通过杂交和繁殖培育而成。大花蕙兰是重要的商品盆花和鲜切花之一, 花型大、色彩鲜艳、生长强健, 但是缺少国兰的幽香。国兰是指兰属植物中的一部分地生种, 主要包括春兰C.goeringii, 春剑C.goeringii var.longibracteatum, 蕙兰C.faberi, 建兰C.ensifolium, 墨兰C.sinense, 寒兰C.kanran和莲瓣兰C.lianpan等7个种系。国兰不仅花型小巧、极具芳香而且叶态优美, 深受人民喜爱。利用大花蕙兰和国兰进行杂交育种的工作近几年已经引起不少学者的重视。花粉活力和柱头可授性是直接影响兰科植物杂交成功的重要因素之一。早期的兰科植物花粉活力研究主要集中在离体萌发培养基成分的筛选方面, 例如蔗糖浓度的选择、植物激素以及柱头粗提物或提取液等外源添加物。王利民等报道了大花蕙兰杂交品种花粉的离体萌发特性;郭丽霞等对海南原生的墨兰花粉进行了离体培养萌发研究。但对于大花蕙兰和国兰的花粉活力测定及柱头的可授性则未见报道。本研究在前人研究的基础上, 对大花蕙兰和国兰花粉活力与柱头可授性进行了分析, 旨在为兰花杂交育种工作提供参考与借鉴。 1 材料和方法 1.1 大花推动兰与国兰的开花试验 如表1所示:供试验的大花蕙兰材料来自云南, 品种有‘绿宝’‘Emerald’, ‘光彩’‘Shine’, ‘皇后’‘Princess Nobuko’, ‘梦境’‘Wanderland’, ‘龙袍’‘Nachi Yellow’等5个品种。国兰材料来自浙江、四川和云南, 共选取4个不同的种或品种。观察记录开花时间并做好标记, 对大花蕙兰设定0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 d等13个开花时间, 对国兰设定0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 d等7个开花时间。在所设计的开花时间分别采集花粉和柱头带回实验室进行试验。 如图1所示:大花蕙兰与国兰的花粉均为4个花粉块, 两两相连, 花粉块为黄色位于合蕊柱先端的药帽之下。试验前用玻璃棒将软硬程度不同的花粉块轻轻碾压为粉末状。稍硬的花粉块可在轻压后放入少量蒸馏水, 然后搅拌, 花粉块则在水中分散开。 1.2 测定花粉的生活能力 1.2.1 花粉的生活力 TTC染色法是根据花粉粒的呼吸酶活性来判断花粉生活力, 呼吸酶的活跃情况能较准确地反映花粉生活力的强弱, 同时氧化还原染料能在呼吸酶的作用下着色。将不同种或品种和不同开花时间的花粉分别加入体积分数为0.5%TTC溶液染色, 染色后在100倍体视镜下观察染色情况, 统计花粉染色率, 花粉生活力 (%) = (有活力的花粉/观察花粉总数) ×100。试验重复3次。 1.2.2 花粉活力的测定 参照赵宏波等的方法配置碘-碘化钾溶液。取9个种或品种不同开花时间的花粉, 分别加入碘-碘化钾溶液, 置于30℃的恒温箱中20~30 min后, 在光学显微镜下观察花粉活力, 试验重复3次。 1.2.3 花粉活力的测定 同样取9种或品种不同开花时间的花粉, 分别加入体积分数为45%醋酸洋红溶液, 置于25℃的恒温箱中20~30 min, 然后在光学显微镜下观察花粉活力, 试验重复3次。 1.3 条件三:最有利于授粉时间 兰花接受花粉的部位在药帽下的腔内, 腔内充满无色透明的分泌物, 如果分泌物油光发亮, 则表示是最好的授粉时间。分别将大花蕙兰开花后0~80 d的柱头和国兰开花后0~40 d的柱头剪下, 放入联苯胺-过氧化氢溶液中, 观察10 min, 若柱头有可授性则会使周围反应液变蓝并出现大量气泡。这是因为氧化物酶活性降解过氧化氢和氧化联苯胺。试验重复3次。 2 结果与分析 2.1 各品种花粉活力检测 研究发现:TTC染色法的最佳观察时间是染色后12 h。大花蕙兰与国兰的花粉活力均随着开花时间的延长, 经历从弱变强再变弱的过程 (图2) 。大花蕙兰在开花后0~25 d内花粉活力处在增长期, 25~35d的花粉活力最佳, 35 d后花粉的活力开始变差。各品种间花粉活性有一定差异, 花粉活力大小依次为‘绿宝’‘光彩’‘皇后’‘梦境’‘龙袍’。国兰在开花后0~15 d内花粉活力处于增长期, 15~25 d的花粉活力最佳, 30 d花粉的活力开始变差, 各品种花粉活力大小依次为春兰‘黄金荷’春兰‘宋梅’春剑莲瓣兰。 用碘-碘化钾染色法染色的大花蕙兰与国兰花粉, 在体视镜下 (放大100倍) 没有观察到明显的颜色变化。在低温和高温处理以及时间做相应的延长调整后进行观察, 染色效果也不好。用碘-碘化钾染色后的国兰花粉比大花蕙兰的染色效果略明显。醋酸洋红染色法的染色原理是靠花