氯化两面针碱对多药耐药细胞的抗癌作用.docxVIP

氯化两面针碱对多药耐药细胞的抗癌作用 多药残留是肿瘤化疗失败的主要原因之一。克服多药多叶药物是治疗肿瘤的一个难题。近年来,国内外学者发现了多种多药耐药逆转剂,但均因靶点单一、体内逆转效率低及毒副作用大而难以应用于临床。 因此, 在进一步寻找高效、低毒的MDR逆转剂的同时,从丰富的中草药资源中筛选对MDR细胞敏感的抗癌活性成分成为克服多药耐药的另一条重要途径。氯化两面针碱是我国学者黄治勋等从两面针[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC.]植物的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱。据报道,其体外对Lewis肺癌、人鼻咽癌、肝癌和慢性粒细胞白血病细胞等有杀伤活性,对耐药肿瘤细胞的作用尚未见报道。我们研究发现,氯化两面针碱对人口腔鳞癌细胞(KB细胞)增殖具有抑制作用(待发表),本研究观察了其对人口腔鳞癌耐药细胞KBV200生长的抑制作用。 1 材料和方法 1.1 基因组织及仪器 氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定所(批号:110848-20001,纯度98%);胰蛋白酶和噻唑蓝(MTT)购于美国Amresco公司;RPMI-1640培养基购于美国Gibco公司;新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司;Hoechst 33258购自北京普利莱基因技术有限公司;天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3) ELISA 试剂盒购自奥地利MedSystems Diagnostics GmbH公司;RNase购自美国MBI公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI)购自美国Sigma公司。Epics-XLⅡ型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品,使用Multicycle AV分析软件;Model-450酶联免疫检测仪:美国Bio-Rad公司;LeicaDMR+Q550荧光显微镜:德国莱卡公司;JEM-1200EX型透射电镜:日本电子公司;CO2培养箱:美国Forma Scientific Inc公司。 1.2 血清rpmi-1330的培养 人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200购自中科院细胞库,置37℃,5%CO2的培养箱中,用含10%新生牛血清以及青、链霉素各100 kU·L-1的RPMI-1640培养液培养,培养时加长春新碱(vincristine,VCR)至200 nmol·L-1以维持其多药耐药性, 实验前停药1周。倒置显微镜观察细胞生长情况,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。 1.3 细胞抑制浓度mic 将氯化两面针碱用二甲亚砜(DMSO)助溶,用基础培养基依次倍比稀释成5个浓度的母液,调整各浓度中DMSO含量至一致。取对数生长期细胞,以每孔0.19 mL(约3×103细胞)接种于96孔板培养12 h,待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的氯化两面针碱10 μL,使其终浓度分别为0.75,1.5,3,6和12 mg·L-1,对照组加含0.5% DMSO的基础培养基。每个浓度设4个复孔,孵育48 h每孔加入10 μL MTT(5 g·L-1),继续培养4 h后倾去培养液,每孔加入DMSO 0.15 mL,平板振荡器振荡5 min,充分溶解蓝紫色颗粒,空白孔调零,用酶标仪以570 nm和630 nm双波长测定吸光度(A)值, 用logit法计算半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次,计算±s。 1.4 细胞氧基化反应 Hoechst 33258为透膜性荧光染料,可与细胞核DNA结合,故正常细胞和凋亡细胞均可被Hoechst 33258着色,但是正常细胞核的Hoechst着色较浅;而凋亡细胞由于细胞体积缩小,染色质固缩浓集而呈浓染致密的亮蓝色颗粒状荧光。氯化两面针碱0,3,6和9 mg·L-1与细胞作用48 h后,收集细胞,用PBS洗涤,按文献方法进行染色,荧光显微镜下每组观察3张片子,每片观察3个视野,统计每个视野下100个细胞的凋亡率。 1.5 用女性法检测细胞cappose3的含量 氯化两面针碱6 mg·L-1预处理细胞48 h,按照ELISA试剂盒说明书制备样品并测定caspase 3含量。 1.6 流式细胞周期检测 氯化两面针碱3 mg·L-1与细胞作用0,12,24,和48 h,用PBS冲洗细胞2次,按文献方法染色,用流式细胞仪检测,MultiCycle AV软件进行细胞周期分析,计算各期细胞百分率。 1.7 统计处理 数据用xˉ±sxˉ±s表示, 组间比较使用SPSS软件(13.0) 进行单因素方差分析和Dunnettt比较。 2 结果 2.1 氯化药物对膜免疫药物细胞生长的影响 如图1所示, 氯化两面针碱与KBV200细胞作用48 h,随着药物浓度增加,细胞存活率降低,呈浓度依赖性抑制作用(r=-0.956,P0.01), IC50值为(2.43±0.19)mg