人参皂甙对急性肾衰大鼠肾保护作用与下丘脑室旁核cha免疫反应活性的影响.docxVIP

人参皂甙对急性肾衰大鼠肾保护作用与下丘脑室旁核cha免疫反应活性的影响 急性肾衰竭（arf）是一种临床疾病，具有以急性肾衰竭为特征的严重妊娠。死亡率很高，严重危险而且患者的生命。据国外的文献报告在过去的二十年里,急性肾功能衰竭的发病率呈上升趋势,急性肾功能衰竭患者经透析治疗的死亡率仍高于50%。目前临床上关于急性肾功能衰竭的治疗,主要靠早期血液透析挽救患者生命,但费用极高,病人难以承受;而且仪器设备昂贵,技术水平要求高,难以在我国推广。因此,寻找简便易行、经济又有效的药物,是挽救急性肾功能衰竭病人生命的关键所在。 传统中医以益气养阴方法,将生脉饮合增液汤用于治疗急性肾功能衰竭,并且对缺血再灌注肾损伤有作用,其主要成分为西洋参等。人参皂甙(ginsenoside,GS)是从西洋参、人参等根、茎中提取的主要有效成分,具有多种生物学活性。有报告口服人参皂甙对糖尿病大鼠肾损伤有保护作用。另有报告口服人参茎叶皂甙可阻止D2半乳糖致衰老大鼠下丘脑超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)活性下降。 本实验用整体实验和免疫组织化学的方法,通过观察肾功能、肾皮质匀浆丙二醛和谷胱甘肽水平的变化以及下丘脑室旁核胆碱乙酰转移酶免疫反应活性(choline acetyltransferase-immunorectivity, ChAT-IR)的变化,探讨口服人参皂甙抗急性肾衰与肾保护的作用及其与下丘脑室旁核胆碱能神经元活性变化的相关性。 1 材料和方法 1.1 急性肾衰模型制备 选用健康雄性SD大鼠,体重180 ~220 g,由大连医科大学实验动物中心提供。室温,自由进食饮水,自然昼夜。 动物随机均分为4组,即ARF+GS组、ARF+NS组、 NS+NS组 、NS+GS组。①实验给药组(ARF+GS组):大鼠禁水16 h后,一侧后肢肌肉注射50%甘油生理盐水,剂量为1 mL/100 g,制备急性肾衰模型。模型制备成功后,即刻给予12.5 mg/mL人参皂甙(GS)生理盐水溶液2 mL 口服灌胃。2次/d,间隔6 h,连续给药48 h。②实验对照组(ARF+NS组):急性肾衰模型制备成功后,即刻给予相同体积的生理盐水口服灌胃。2次/d,间隔6 h,连续给药48 h。③空白对照组(NS+NS组):大鼠禁水16 h后,一侧后肢肌肉注射相同剂量的生理盐水后,即刻给予生理盐水2 mL口服灌胃。2次/d,间隔6 h,连续给药48 h。④空白给药组(NS+GS组):大鼠禁水16 h后,一侧后肢肌肉注射相同剂量的生理盐水后,即刻给予12.5 mg/mL人参皂甙(GS)生理盐水溶液2 mL口服灌胃。2次/d,间隔6 h,连续给药48 h。 1.2 免疫组化试剂 甘油购自浙江省兰溪化工总厂,人参皂甙购自吉林省宏久生物科技股份有限公司,尿素氮(BUN)测试盒、肌苷(Cre)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒和还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒购自南京建成生物工程研究所,牛血清白蛋白(BSA)和二氨基联苯胺(DAB)购自美国Sigma公司,其他免疫组化试剂购自武汉博士的公司。 1.3 肾皮质匀浆氧化应激 40只健康雄性大鼠经人参皂甙或生理盐水处置48 h后,4%水合氯醛腹腔注射麻醉,取血,制备血清,测定血BUN和Cre;取肾脏,制备10%肾皮质匀浆,测定肾皮质匀浆MDA和GSH。另取40只大鼠经人参皂甙或生理盐水处置48 h后,经心脏灌流,取脑,于4%多聚甲醛内后固定,然后置入含20%蔗糖的磷酸盐缓冲液中。用振动切片机切取50 μm厚冠状脑片,按George Paxinos﹠Charles Watson脑立体定位图谱,用中性红染色在低倍镜下挑选以下部位的脑片[前囟后1.80~2.12 mm(Bregma:-1.80~-2.12 mm)]为室旁核所在部位,进行免疫组织化学实验。 1.4 chat一抗羊抗兔 ① 4组大鼠脑片先用0.01 mol/L PBS振荡漂洗2次,每次10 min。② 0.2%Triton孵育5 min,0.01 mol/L PBS振荡漂洗3次,每次10 min。③ 2% BSA孵育30 min。④ 加ChAT 一抗(1∶100),4℃孵育过夜。⑤用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min。⑥ 2% BSA孵育20 min。⑦ 生物素化的二抗(羊抗兔)室温孵育2 h,用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min。⑧ SABC孵育2 h后,0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min。⑨ DAB显色,二甲苯透明,中性树胶封片。⑩ 光镜(Olympus A.H-B-L万用显微镜,日本)下观察并摄片。 1.5 室旁核chat免疫反应阳性神经元的表达分析 用Image Pro Plus Image Analys