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电纺丝制备plapcl复合纳米纤维支架及其性能研究 如何构建符合自然微细胞外基质结构和功能的组织工程支撑材料，为种子细胞提供良好的生长、繁殖和功能表现环境，以及对细胞的诱导和影响。静电纺丝在纺织工业和聚合物领域中不断得到应用, 近年来在生物高分子支架方面的新奇应用更是引人注目。 在修复重建器官组织的研究中, 支架材料是先导。PLLA、PCL是FDA认可的生物材料, 具有良好的生物相容性、无毒性, 且可生物降解, 在组织工程中的应用极为广泛, 在骨、软骨、人造皮肤、周围神经修复等方面均可作为细胞生长载体使用, 并且已取得了令人满意的成果。本实验采用静电纺丝方法, 制备了PLLA/PCL复合纳米支架, 并对支架的结构和性能及细胞相容性进行了测试和评价, 初步探讨了其在组织工程支架材料领域的应用前景。 1 实验部分 1.1 材料、试剂与试剂 PLLA:宁波环球塑料制品有限公司;PCL:上海天清材料有限公司;DMF、三氯甲烷、脂肪酶:国药集团上海化学试剂公司;人真皮成纤维细胞:上海组织工程研究与开发中心。 1.2 静电纺丝工艺 配制不同PLLA/PCL比例的DMF/CHCl3(40/60) 共混溶液各10 mL, PLLA+PCL的质量分数为10%, 搅拌、隔夜放置使其充分溶解并混合均匀。 采用东华大学实验室自制的静电纺丝仪 (单轴电纺) 对共混溶液进行静电纺丝。通过反复调整静电纺丝工艺参数, 最后确定最佳纺丝条件:电压 (12 kV) 、接收距离 (12 cm) 和出样速率 (1.2 mL/h) 。将接收屏上的铝箔烘干后进行剥膜便得到PLLA/PCL复合支架。 1.3 支架材料的力学性能 采用瑞士METTLER TOLEDO公司的差示扫描量热分析仪 (DSC822e) 测定试样降解前后的热力学性质, 升温速率10 ℃/min;日本电子株式会社的扫描电子显微镜 (JSM-5600LV) 观察支架降解前后的表面形貌;德国Dataphysics公司的光学视频接触角测量仪 (OCA40) 测试支架材料的水接触角;日本Rigaku公司的X射线衍射仪 (Dmax-rB) 用来表征支架材料的结晶性能。 1.4 脂肪酶活性测定 将PLLA/PCL电纺膜切成2cm×2cm的小块, 膜的厚度为0.06 mm, 降解在磷酸盐缓冲液中进行, 缓冲溶液pH值为7.4±0.2。缓冲液中脂肪酶浓度为0.2 mg/mL。将上述样品放在一振荡培养箱中, 温度保持在 (37±0.2) ℃。每隔1 d, 分别从瓶中取出样品, 用蒸馏水将样品冲洗三次, 然后用滤纸吸干表面水分后称量。将样品在35 ℃真空烘箱中干燥至恒量后再称量。每次取样后都更换新鲜的酶溶液以确保酶的活性。实验数据取三个样品的平均值。样品的吸水率和失重率可由公式 (1) 和 (2) 确定: 式中:M2,M1和M0——样品降解前的质量及样品降解后的干质量和湿质量。 1.5 细胞培养的人真 将支架制成1 cm×1 cm的正方形, 用酒精浸泡支架2 h, 用紫外光照1 h～2 h灭菌。加入细胞培养液 (含10%胎牛血清的DMEM) 浸润过夜, 接种细胞前将材料移至24孔板。 原代培养的人真皮成纤细胞体外传代培养至2代, 待细胞铺满培养皿底部时, 用0.25%胰酶消化成1.6×104/mL细胞悬液, 加入预先铺有支架薄膜96孔培养板, 每孔200 uL, 在37 ℃, 5%二氧化碳培养箱中培养一周时间, 每隔2d更换一次培养基, 以保持细胞的营养供应。 细胞形态的观察:待细胞在样品表面培养7d后, 取出细胞-样品复合物, 用缓冲溶液洗去残余培养液, 将细胞支架样品放入3%的戊二醛溶液中, 4 ℃固定一天, 然后用乙醇溶液逐步脱水, 每步处理15 min～20 min左右, 最后将样品临界点干燥, 喷金, SEM观察细胞在样品表面的粘附和伸展情况。 2 结果与讨论 2.1 纤维复合化的网络结构 Fig.1为不同PLLA/PCL配比共混液用静电纺丝法所制备的纤维表观形貌SEM照片。由图可见, PLLA、PCL及其共混物的可纺性较好, 所制备的纳米/亚微米纤维交织形成的三维网络结构, 较好地模拟了天然细胞外基质中蛋白纤维的尺寸和结构;相互连通的孔隙有利于细胞的长入、营养物质代谢产物的交换以及细胞的迁移。 2.2 细胞黏合性 电纺纤维毡的亲水性是影响生物材料与细胞相互作用最初行为的关键因素, 亲水性好能促进细胞粘附。 Tab.1数据表明, 随着PCL比例增加, 材料的水接触角减小, 但变化不明显。 2.3 pla纤维的结晶性能 Fig.2为PLLA/PCL支架的熔融DSC曲线, 由图可见, 纯PCL支架的熔融峰只有一个, 峰值为60 ℃左右;而纯PLLA支架的DSC测试结果出现两个吸热峰, 一个峰值在64 ℃左右, 另一