纳米羟基磷灰石明胶仿生复合材料的理化性质及细胞相容性研究.docxVIP

纳米羟基磷灰石明胶仿生复合材料的理化性质及细胞相容性研究 充足的骨骼是牙齿种植和长期成功率的先决条件。然而临床上经常见到因各种原因引起的受植区骨量不足情况, 所以骨修复材料的研究和开发是目前的热点问题, 是生物材料研究中一个非常活跃的领域。 纳米羟基磷灰石 (nanohydroxyapatite, n HA) 是目前公认具有生物活性的材料, 与人体骨骼成分和结构更为相似, 有助于细胞及体内的大分子对其进行识别, 从而使得材料的生物活性、利用度和生物相容性得以提高, 并在表面面积、细胞亲和性和体内降解速率等方面也具有更佳的性能。研究表明在成骨分化的晚期, 成骨细胞分泌大量胞外基质并发生矿化, 其产物就是纳米级的羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HA) 。在骨缺损修复方面也展现良好的生物相容性和骨传导性。尽管n HA作为骨修复材料优势明显, 但仍存在脆性大、骨诱导活性低、机械强度和力学性能相对较差及塑型困难等问题。复合材料是近几年研究和应用最为广泛的一种骨修复材料, 是两种或两种以上材料的合成。材料之间的复合可以满足机体多样性的要求, 又可以同时发挥它们各自的优势, 更好地实现其在生物体内的修复功能。因此n H A与其他材料复合是提高生物相容性和力学性能的一种有效途径。目前有很多复合材料表现出较好的生物相容性和力学性能, 如n HA/胶原、n HA/壳聚糖及n HA/聚乳酸等。 明胶是胶原在酸、碱、酶等的作用下发生化学变化或在光、紫外线、热等物理条件作用下的变性产物, 与胶原一样由氨基酸组成, 是一种天然高分子蛋白类材料。明胶具有很多优异的物理化学性能, 如胶体保护性、成膜性、表面活性、凝胶与溶胶态可逆转变、两性聚电解质特性以及侧基的高化学反应活性, 使其成为最早并且最重要的商品化蛋白质;明胶来源丰富, 具有良好的细胞相容性, 还具有较好的黏附作用和被人体降解吸收等特点, 且相对胶原而言, 具有水溶性、无毒、无抗原性、价格相对便宜等优点。另外, 研究表明:明胶的氨基酸成分里富含羧酸根负离子, 在适当温度条件下, 能与羟基磷灰石的钙离子形成化学键, 诱导羟基磷灰石的成核和生长, 利于复合材料的自组装和生成。天然的骨间质是由纳米级低结晶的磷灰石和少量碳酸钙与胶原纤维有机组合而成的三维结构。从仿生学的角度看, n HA与明胶复合不仅可以提高生物相容性和力学性能, 而且两者的复合从成分和结构上更好地模拟天然骨。因此n HA/明胶复合物有望成为新型骨组织工程支架材料。本研究拟利用冷冻干燥方法将n HA和明胶制备成与天然骨组织相似成分的仿生多孔支架材料, 旨在为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 仪器、试剂和试剂 n H A和明胶系上海晶纯实业有限公司产品;戊二醛、乙醇系广州化学试剂厂产品;恒温磁力搅拌器 (MR3001) 系德国Heidolph公司产品;冷冻干燥机系美国Labconco公司产品;扫描电镜 (FEI Q u a n t a 2 0 0) 系荷兰F E I公司产品;傅里叶变换红外光谱仪 (EQUINOX 55) 系德国Bruker公司产品;DMEM低糖培养基、胰蛋白酶及II型胶原酶系美国G i b co公司产品;胎牛血清为以色列B i o i n d公司产品;MTT粉剂为美国Sigma公司产品;碱性磷酸酶试剂盒系南京建成生物工程研究所产品;TECAN SUNRISE酶标仪为瑞士Tecan公司生产。 1.2 方法 1.2.1 工作时间 在Azami等的实验方法基础上略有改进。将2 g明胶溶于20 m L去离子水中, 加入1 g n H A, 于4 0℃恒温、磁力搅拌器1 0 0 0 r/m i n持续搅拌45 min。待反应结束后将悬液倒入塑料模具中, 放入-20℃冰箱过夜, 冷冻干燥24 h, 将复合物制成理想大小和形状后用1%戊二醛于4℃交联24 h, 之后分别用75%乙醇和去离子水漂洗3次, 逐步除去多余的戊二醛和乙醇, 置-80℃冻存后冷冻干燥2 4 h, 得n H A/明胶多孔支架材料, 将材料封装, 用钴-60灭菌 (25 k Gy, 广州华大生物科技有限公司) , 备以后实验中应用。 1.2.2 环境扫描电子显微镜观察 把干燥的复合材料修整成小块, 粘于小圆形金属板上, 用离子溅射仪喷金镀膜后用Quanta 200环境扫描电子显微镜观察支架材料的微形貌、孔径大小、连通性、孔壁等结构。 1.2.3 材料的红外光谱 采用溴化钾 (K B r) 压片法制备样品, 在4 000~400 cm-1光谱范围内测定样品红外光谱。 1.2.4 压缩强度测定 采用WD-5A型电子万能材料试验机测试样品的抗压强度, 待测样品加工成直径8 mm, 长度为15 mm的圆柱状, 加载速率0.5