nk1受体阻滞剂对电针大鼠内关穴抗ami损伤效应的自主神经及中枢sp、nos的影响.docxVIP

nk1受体阻滞剂对电针大鼠内关穴抗ami损伤效应的自主神经及中枢sp、nos的影响 通过相关实验，p物质和氧化氮基因（nos）是电针内关穴抗急性心肌缺血（acutionianacademyclovac细胞（pmi）损伤效应的重要物质。刘强等研究提示心脏和内关穴区的神经纤维有一部分来自脊神经节和迷走神经节中的同一个神经元。这为电针内关穴抗AMI损伤与心自主神经参与提供了有力依据。由于SP广泛分布于心血管中枢,为探讨SP在自主神经及其中枢对电针内关穴抗AMI损伤效应中的作用机制,拟开展本实验。由于NK1受体对SP最敏感,是中枢SP作用的主要受体, NK1受体阻滞剂能透过血脑屏障,因此本实验选择静脉注射NK1受体阻滞剂,观察电针内关穴对AMI大鼠自主神经作用效应及中枢SP、NOS阳性表达,进一步分析SP在内关-心脏相关中的作用。 1 材料表面 1.1 实验动物 SD大鼠30只,体重180～200g,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供,普通级,动物合格证号:610103。 1.2 聚氨基四氮唑蓝的合成 100μL,购自CHENICON INTNATION AL(AM.);即用型SABC免疫组化染色试剂盒:购自武汉博士德生物公司;NADPHNa4:25mg,购自Biosharp(AM.);3-3-DAB.4HCl(3-3二氨基联苯胺盐酸盐):1g,购自Amresco,由荟萃生物公司提供;氯化硝基四氮唑蓝:250mg,购自科瑞生物公司(上海,英国分装);NK1受体阻滞剂:L-703606,5mg,FW598.5,SIGMA。 2 方法 2.1 股静脉采血试验 20%乌拉坦给于大鼠腹腔注射麻醉(5mL/kg),按6U/kg比例股静脉注入垂体后叶素(pituitary,Pit)注射液(6U/mL,蚌埠市宏业生化制药厂,批号020612)观察心电图在1min内出现心率明显减慢、T波显著高耸,或ST段抬高0.1 mV为造模成功。 2.2 神经节的分离 交感神经放电记录 大鼠麻醉后手术台仰卧固定,颈部剪毛,碘伏消毒,在喉头与胸骨间沿颈正中线作长约2.5～4cm的切口,寻找右侧颈动脉鞘(内有颈动脉及迷走神经)后,分离出迷走神经主干约1～2cm,并以4号线从中间引出备用;在左侧颈总动脉后、椎前肌浅面、椎体旁,将椎前筋膜用玻璃分针纵向剥离,找出颈交感干,沿交感干向下找出颈下神经节,用细线穿过神经下方引出备用。将分离的右侧迷走神经、左侧交感神经分别挂上BL-420E+生理仪(成都,泰盟)银丝电极,记录神经放电情况,记录中石蜡油湿润神经,记录时间25min。 2.3 小鼠海马的组织病理学检测 切片 打开大鼠胸腔,经升主动脉插管,先用0.9%Nacl注射液100mL快速灌注,后用4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS液(Ph 7.4)400mL先快速、后缓慢灌注固定50～60min。灌注完毕立即取完整脑组织及C7～T7段脊髓放入上述相同的新鲜固定液中固定4h,再移入25%蔗糖溶液过夜沉底(4℃),次日取出组织作恒冷箱连续冠状切片,片厚40μm。按大鼠脑定位图谱,留海马出现至海马伞体积最大显示之间切片20张/只;切取延髓第四脑室至中央导水管段留片20张/只;切取脊髓C8～T2段留片20张/只。上述切片0.01mol/L KPBS液4℃保存。 2.4 sp抗体-igg-sp-100-u 切片漂洗(入0.01mol/L KPBS液漂洗10min×3次,下同);浸入80%甲醇双氧水(双氧水浓度为0.3%)30min(4℃),漂洗;入含0.3%Triton X-100的0.01mol/L的KPBS缓冲液摇床30min;入SP抗体(稀释浓度1:1000)4℃孵育48h,漂洗;入生物素化羊抗兔IgG(稀释浓度1:0)4℃孵育12h,漂洗;入SABC复合水(释浓度1:0)4℃孵育12h,漂洗;显色,漂洗;贴片\干燥;脱水;明胶封片。 2.5 u3000结论 切片漂洗;入含0.3%Triton X-100的0.01mol/L KPBS缓冲液摇床30min,漂洗;入孵育液(硝基四氮唑蓝2mg溶入含0.3%Triton X-100的0.01mol/L KPBS液10ml中,抽出1ml加入NADPH1mg,37℃2h),漂洗;贴片\干燥;脱水;明胶封片。 2.6 神经放电检测 SD大鼠30只,随机分为正常组(A组)、模型对照组(B组)、电针内关组(C组)、阻滞剂组(D组)、阻滞剂+电针内关组(E组),每组6只。各组处理方法如下: 正常组(A组):分离神经、记录神经放电,分别于第0min、3min、8min、13min、23min标记,之后脊髓、脑固定并取材、切片,检测SP、NOS。 模型对照组(B组):分离神经、记录神经放电,第3min造模,分别于造模前、造模后0