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下丘脑室旁核胃动素与胃运动调节 胃动素是一种含有22个氨基酸的多媒体矩阵，主要从肠道顶部的嗜铬细胞（ec2）排出，并在消化间转化。根据文献，腹部胃运动的恶化与血浆中胃动素浓度的变化规律一致。血浆胃素浓度的变化与各种因素有关。其中之一是十二指肠腔的ph值。根据研究，一些部落的人和猪通过磺酸脱水产生胃动素。近年来有文献报道,除消化道外,胃动素还广泛存在于中枢神经系统内,包括大脑皮层、下丘脑、小脑、垂体及松果体,但对于中枢胃动素参与的作用及其机制尚未明了。本工作旨在探讨下丘脑室旁核内胃动素神经元的存在和外源性胃动素注入室旁核对胃运动的影响及其机制。 1 材料和方法 1.1 胃动素免疫阳性细胞的免疫组织化学染色 1.1.1 动物实验前饮食 实验选用Wistar大鼠20只,雌雄兼备,体重200～300 g,随机分为四组,每组5只:正常饮食组(对照组)、饥饿组、灌酸组、及手术对照组。正常饮食组实验前正常饮食,不作任何处理;饥饿组大鼠实验前禁食18～24 h,自由饮水;灌酸组动物实验前自由饮食,在胃十二指肠连接处将一直径2 mm管插入十二指肠(远端结扎),灌入0.1 N盐酸1 ml,保留5 min后断头取脑;手术对照组实验前自由饮食,在胃十二指肠连接处将一直径2 mm管插入十二指肠(远端结扎),灌入生理盐水1 ml,保留5 min后断头取脑。 1.1.2 中性红在pbs和abc染色法 四组动物断头取脑后,所需脑段(前囟至前囟后3 mm)入4%多聚甲醛固定2 h,PBS冲洗组织,20%蔗糖浸泡过夜(4℃)。作额状面连续冰冻切片,厚15 μm,用ABC染色法显示,中性红轻度复染,阴性对照以PBS代替第一抗体,其余步骤相同。(所用胃动素抗体由比利时安特卫普大学Timmermans教授提供。) 1.1.3 每隔麻黄取张数。每隔张数 每只大鼠取5张切片计数室旁核胃动素神经元阳性细胞数(每隔四张取一张)。每张切片在室旁核阳性细胞密集处观察4个互不重叠的高倍镜视野计数阳性细胞,4个视野阳性细胞数总和为该切片室旁核的阳性细胞数。 1.2 动物脑段内甲醛微核试验 实验选用Wistar大鼠8只,雌雄兼备,体重200～300 g。8%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后,固定在脑立体定位仪上,参照Paxinos-Waston图谱,迷走背核的坐标为:A 12.8 mm, R 0.9 mm, H 8.1 mm,用尖端内径50 μm的微玻管缓慢注入30%HRP(购自Promego RZ3.0)溶液0.2 μl,动物存活40～48 h后,经左心室-升主动脉插管,先快速灌注生理盐水50 ml,随后慢灌注500 ml 4%甲醛,切取相关脑段(前囟至前囟后3 mm)置入4%甲醛固定2 h,20%蔗糖浸泡12～24 h(4℃)。冰冻切片40 μm,按Mesulam的TMB呈色反应。用1%中性红染液复染。明暗视野显微镜(BX-50,OLYMPUS)下观察。 1.3 大鼠胃运动的记录 1.3.1 术后观察及实验分组 实验用Wistar大鼠34只,雌雄兼备,体重200～300 g。手术前禁食18～24 h,自由饮水,8%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,将记录胃平滑肌收缩运动的自制应力传感器缝在距幽门十二指肠连接处0.5 cm处的胃窦浆膜上,导线通过颈背部伸出。将大鼠头部固定在脑立体定位仪上,按照Paxinos-Waston图谱室旁核坐标为:A 1.8 mm,R 0.5 mm,H 8 mm。将直径2 mm的外套管植入,以502胶和牙托粉固定,外套管中植入内芯,防止堵塞。术后每天腹腔给予青霉素钠2万单位以预防感染。术后3 d可进行实验。 记录前动物禁食18～24 h,自由饮水,给药前先观察60 min胃运动,待记录平稳后,室旁核微量注射胃动素 0.37 nmol/L(n=8)、或CCK-8 0.043 nmol/L(n=6)(左或右侧),注射量为0.5 μl,观察胃运动频率和幅度的变化。对照组注射生理盐水。(胃动素由比利时鲁汶大学胃肠激素研究室Peeters教授提供;CCK由美国匹兹堡大学Verbalis教授提供) 行膈下迷走神经切断术的动物(n=12),术后5 d进行实验。实验组(n=6)微量注射胃动素,对照组(n=6)注射生理盐水,注射量及记录时间均与前述迷走神经完整组一致。 实验结束后,动物经心脏以生理盐水和4%甲醛灌注固定脑部,作50 μm系列冠状切片,观察脑内套管轨迹,确定注射位置是否准确。 1.3.2 计算结果 统计计算给药后胃收缩波频率及振幅指数(单位时间内收缩波振幅总和)较给药前收缩波频率及振幅指数的变化百分数,计算公式为: 1.4 统计处理 实验结果均以均数±标准差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,组间差异显著性采用t检验方法。 2 结果 2.1 免疫组化检测 在正常对照组下丘脑的