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i型胶原与脂肪干细胞的生物相容性研究 脂肪干燥能促进血液循环，具有多向分化潜力，对各种组织的损伤有良好的修复效果，而且易于消化。这是组织工程研究中的一个重要种子细胞之一。理想的种植材料应具有良好的生物相容性,对细胞、组织等无毒性。不同材料对细胞的生长、分化和黏附均有不同的影响,因而种子细胞能否在支架材料上良好生长,并表达自身特异性功能是目前组织工程研究的一个热点。本实验首次用人脂肪干细胞与I型胶原支架材料进行体外混合培养,了解支架材料对细胞粘附、生长、增殖等功能的影响,以便寻找适宜的脂肪组织工程细胞载体,为进一步的体内实验提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料和细胞培养板 DMEM、特级胎牛血清由Gibco公司生产;I型胶原酶、胰蛋白酶、I型胶原支架材料、四氮唑复合物(XTT),硫酸酚嗪甲酯和二甲基亚砜均购自Sigma,12孔细胞培养板购自Corning。 1.2 方法 1.2.1 细胞活性检测 取人吸脂术中吸出的脂质部分,用缓冲液反复冲洗,剪刀剪碎。0.1%胶原酶37℃消化40 min,期间需反复震荡混匀1次,使用等量体积的完全培养基中和后,离心1300×g 5 min,去上清,沉淀混悬后使用肽盼蓝染色检测细胞活性,加入10%DMEM培养基中,37℃5%CO2孵箱培养过夜。待细胞生长融合达80%即可传代,取第3~4代细胞供实验用。 1.2.2 培养液的消毒 将胶原蛋白支架材料裁制成10 mm×10 mm×1 mm大小,利用紫外线照射及酒精浸泡消毒,培养液平衡后待用。培养的脂肪干细胞消化后制成细胞悬液,细胞密度为2×105/ml,表面种植0.2 ml细胞悬液,静置4 h后,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO2培养箱中培养。 1.2.3 独立显微镜观察 1.2.4 kasen报道的方法用于确定细胞的依赖度 1.2.5 加材料空白对照组 将胶原支架材料7块(5 mm×5 mm×1 mm)分别置于96孔培养板中,并设7孔为不加材料的空白对照组,各4个复孔。将ADSCS以1×104/孔接种于材料及空白孔,置37℃5%CO2孵箱培养3、5、7 d,以主波长450 nm,参比波长630 nm在酶标仪上比色,测定吸光度A值。 1.2.6 扫描电子观察 1.2.7 统计处理 2 结果 2.1 培养时间和支架对细胞毒性的影响 刚接种的细胞呈圆形,在支架材料内均匀分布;透光性差,24 h内细胞伸展、黏附,透光性增加,不易观测。2~3 d已完全伸展变形,以三角形和梭形为主,呈网状排列;随着培养时间的延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,种植7 d后,细胞数量明显增加,极少细胞从支架上掉落。表明脂肪干细胞能在支架上良好地附着、生长和增殖(图1)。 2.2 子粘附率的检测 经检测,7块复合材料中,每块细胞黏附率均达95%以上,平均达97.9%,说明该支架对细胞有良好的黏附性。 2.3 细胞接种后细胞活性检测 从活细胞吸光度所绘制的细胞增殖柱形图来看(图2),细胞接种后,实验组和空白组随时间延长细胞活性逐渐增加,仍可保持正常的分裂增殖速度,两组之间组相比未见显著性差异(P0.05)。 2.4 表面拉伸、黏附 细胞种植3 d后,细胞呈扁平多角形或圆形,在材料表面伸展、黏附;种植1周后,形态为梭形或圆形,细胞数量明显增多,呈聚集性分布,细胞周围有大量基质,表明脂肪干细胞在支架上粘附、伸展和生长良好(图3)。 3 细胞活性成分的检测 胶原蛋白是目前组织工程学研究中最常用的天然生物材料,由多种糖蛋白分子组成,占机体总蛋白的30%(85%为I型胶原蛋白),它具有多方面的生物活性,不仅是组织支持物,而且是细胞外间质的重要成分。研究表明,胶原蛋白生物相容性好,降解速度可调,而且可参与组织修复,是一类优良的可引导组织再生的生物材料。Ⅰ型胶原作为体外细胞培养支架时,有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用,是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物,不影响内环境p H值,因此不会影响细胞的生长增殖。胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中,已被美国FDA批准作为人工皮肤材料。 本研究利用人脂肪干细胞作为种子细胞,进行体外细胞种植胶原支架,通过倒置显微镜和电镜观察细胞伸展、黏附和生长过程。镜下显示,种子细胞种植胶原材料后,生长状态良好,无明显细胞毒性表现,在培养条件相对稳定的情况下,细胞可以进行正常增殖、迁移并分泌细胞外基质。通过检测,细胞与支架的黏附率达97%以上,说明该支架对细胞有良好的亲和性。 XTT法常用于体外细胞增殖和药敏检测,通过测定活细胞光吸收值,间接反映活细胞数量。本实验中,细胞支架培养复合培养后,材料接种组细胞的增殖未受到不良影响,说明I型胶原支架对人脂肪干细胞无毒性作用。 本实验表明,人脂肪干细胞能在