一种新型ha-gdl交联体系制备的海藻酸钙水凝胶的性能研究.docxVIP

一种新型ha-gdl交联体系制备的海藻酸钙水凝胶的性能研究 水凝胶是软骨组织工程中常用的细胞释放载体和支撑材料。与普通海绵支架相比，水凝胶聚合物网络中充满了大量的水，使整材料具有液体性质，这与体组织的许多组织非常相似。柔软、湿润、柔软的表面和组织的亲和力显著降低了材料对周围组织的刺激。水凝胶支撑机构在组织工程中用于细胞包裹的理想支撑体必须具备以下特点：（1）良好的生物适应性；（2）良好的传质性；（3）适宜的生物降解性。 海藻酸钠(SA)是一种由(1,4)-β-D-甘露糖醛酸(M)和(1,4)-α-L-古罗糖醛酸(G)两种结构单元不规则连接而成的线型天然高分子.当其与Ca2+接触时,可通过GG结构单元中的羧基氧、羟基氧和环间氧与Ca2+配位而瞬时凝胶化形成具有“鸡蛋盒”结构的海藻酸钙水凝胶,成胶条件温和,并且具有良好的生物相容性,因此在组织修复材料、药物控释、细胞免疫隔离等组织工程领域越来越受到人们的关注. 通常是可以将海藻酸溶液滴加到CaCl2溶液中得到海藻酸水凝胶,它常以凝胶珠的形式用在药物控释和细胞包裹等方面.而这一凝胶体系最大的缺点在于凝胶速率不可控,很难得到机械性能强、结构均一、形状复杂的三维结构.目前很多研究者采用CaCO3-葡萄糖酸内酯(CaCO3-GDL)体系,通过CaCO3与GDL的反应缓慢释放Ca2+,可以得到凝胶速率可控的三维海藻酸钙水凝胶.但CaCO3与GDL反应过程中CO2的生成会导致凝胶中存在气泡,进而影响凝胶的力学性能及结构. 本工作采用具有良好生物相容性的羟基磷灰石(HA)作为钙源,开发了一种新型的HA-GDL体系制备海藻酸钙水凝胶,系统比较了HA-GDL和CaCO3-GDL两种体系制得的水凝胶在凝胶形貌、力学性能、凝胶化时间以及溶胀收缩等方面的性能,并将海藻酸钙凝胶与软骨细胞复合体外构建组织工程化软骨,初步考察了该体系用于构建组织工程软骨的潜能. 1 材料和方法 1.1 海藻酸钠溶液的配制 在一定浓度的海藻酸钠(Fluka)溶液中加入一定量的粒径均为40～50μm的CaCO3(成都科龙)或HA(实验室自制),搅拌均匀后加入新鲜溶解的GDL(Sigma)溶液,迅速混匀后铸入模具,室温下充分放置使凝胶化24h.其中GDL与CaCO3和HA的配比分别为n(GDL):n(HA)=14:1,n(GDL):n(CaCO3)=2:1,使HA和CaCO3完全溶解并维持体系pH值为中性.通过调节海藻酸钠溶液的浓度CSA和钙离子与羧基的摩尔比f,分别制备了CSA=2%、2.5%、3%;f=0.27、0.36、0.54的一系列水凝胶. 1.2 材料表面形貌与溶胀率 采用试管倾斜法测定37℃下样品的凝胶化时间,每隔30s倾斜盛装有3mL凝胶样品的试管,直至样品停止流动,记录所需时间.将凝胶化24h的样品冷冻干燥后,通过扫描电子显微镜(SEM,JSM-5900 OL,Jeol,Japan)观察其表面形貌.采用电子万能材料试验机(Instron 556x)测试了凝胶的压缩强度和压缩模量,试样为φ36mm×15mm的圆柱形,加载速度为2mm/min,每组试样平行测五次.将凝胶化24h的试样按0.1g/mL加入MilliQ浸泡,通过测定其质量随时间变化规律考察了各组凝胶在水中的溶胀率.溶胀率计算公式如下: 其中S为溶胀率,w为材料吸水后的质量,w0为凝胶的初始质量. 1.3 小鼠软骨细胞在凝胶内的形态观察 取新生新西兰兔(四川大学实验动物中心提供),处死,无菌条件下提取关节软骨细胞,置37℃,5%CO2培养箱内培养,传代,收集第3代软骨细胞用于实验.将细胞悬液按1×106/mL密度分别接种于凝胶前溶液中,溶液固化成凝胶后加入α-MEM培养基,置37℃,5%CO2培养箱内培养7、14、28d.通过FDA/PI染色观察软骨细胞在凝胶内的形态和分布.将样品以10%甲醛固定24h后,常规石蜡包埋,超薄切片,HE染色,在光镜下观察凝胶内的细胞形态. 2 结果与讨论 2.1 凝胶化速率的提高 如表1所示,随着CSA和f的增大,两体系的凝胶化时间均呈降低的趋势,这是由于海藻酸浓度的增大和钙含量的提高使得海藻酸分子链与钙离子的鳌合更加容易,缩短了反应时间.与传统的CaCO3-GDL体系相比,相同凝胶条件下HA-GDL体系具有较快的凝胶化速率,尤其是在海藻酸钠的浓度和钙含量较低的情况下差异更加明显,这可能是由于HA中PO43-基团也会与海藻酸分子链中羧基形成氢键,加快了凝胶网络结构的形成. 2.2 海藻酸纤维的结构 从两种体系冻干凝胶的SEM照片(图1)中可以看出,海藻酸呈现出交联程度极强、纳米线性交错的网络状结构,与文献中报道的“蛋盒结构”相吻合,纤维直径大概在10～30nm之间,线性分子链层层缠绕,各结点清晰可见. 2.3 凝胶的力学性质