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非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因表达及临床意义 肺癌是目前发病率和死亡率最高的肿瘤，其治疗也是一个吸引人的焦点。以往的化疗和放疗由于缺乏特异性，虽然愈合，但往往给患者带来严重的副作用。因此,选择肺癌细胞特异的分子靶点,应用针对该靶点的药物进行治疗,在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式,越来越被肿瘤学术界和广大患者所认同。肺癌分子靶向治疗常用的治疗靶点有:细胞受体、信号传导和抗血管生成等,其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是目前最为主要的靶点。 表皮生长因子受体在细胞信号传导通路中起重要作用,一旦被激活,可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和受体自身磷酸化,从而促使细胞增生、分化、转移、血管生成及凋亡抑制。EGFR受体抑制剂包括小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)和单克隆抗体。EGFR-TKI通过阻断细胞受体的三磷酸腺苷结合位点,阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。目前,有两种EGFR-TKI(厄罗替尼和吉非替尼)成功在中国上市,其药物特点是口服、高效、高特异性,病人耐受性好,无骨髓抑制和神经毒性,能显著延长敏感患者生存期,改善患者生活质量。但是,大规模的临床实验中亦发现,在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。对未经选择的病人,使用EGFR-TKI的总有效率为8%-12%;而在非吸烟、女性和亚洲人中,有效率高于20%。2004年,Lynch和Paez等首次提出,EGFR-TK对不同NSCLC的治疗效果的差异是由于EGFR外显子的突变状态不同。EGFR外显子19或/和21的突变异常将导致EGFR结合ATP的能力增加,从而加强了TKI的疗效。在不同种族的人群中EGFR的突变率存在显著差异,如Kosaka等报道,日本的NSCLC患者EGFR外显子突变率明显高于美国人和欧洲人。此外,Cappuzzo等亦报道,通过荧光原位杂交检测EGFR的扩增,发现存在EGFR扩增的患者对TKI的疗效较好。 由于EGFR的突变和拷贝数扩增状态与TKI的疗效紧密相关,而且在不同种族的人群中,EGFR的突变状态存在很大的差异。本研究拟以我院肺外科收治的187例非小细胞肺癌患者为研究对象,采用Real-time PCR技术检测EGFR基因19、21外显子的突变,并采用荧光原位杂交(FISH)技术检测EGFR基因的扩增情况,从而分析其与患者临床病理生理特征的关系,探讨EGFR存在状态在肺癌发生发展中的作用,为晚期NSCLC的个体化治疗打下基础。 1 材料和方法 1.1 病例选择及组织分型 选取天津医科大学总医院2006年-2009年8月间手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌标本187例。其中,男性125例,女性62例;年龄31岁-83岁,中位年龄为62岁;有吸烟史的病人119例;根据ICC 1997年新的修订标准进行TNM分期,I期53例,II期22例,III期99例,IV期13例;有淋巴结或/和远处转移者100例;按WHO肺癌组织分类标准进行组织分型,鳞癌96例、腺癌76例、腺鳞癌7例、大细胞肺癌8例。所有患者术前均未接受过化放疗和EGFR-TKI治疗等抗肿瘤治疗。所有标本均以10%福尔马林固定,常规石蜡包埋封存。生存时间从术后第1天算起,截止至2009年11月14日。 1.2 egfr基因检测 采用Real-time PCR Taqman探针技术分析肺癌患者石蜡组织中EGFR外显子19、21突变状况。石蜡组织DNA提取采用TAKARA试剂盒并按说明书步骤进行。首先将3片-5片10μm厚的石蜡切片放于Eppendorf管中,加入DNA抽提液10滴,充分混匀,100oC加热10min,13 000 rpm离心10 min,吸取其上清直接用于Realtime PCR。EGFR基因突变实时荧光定量PCR法检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供,采用Taqman探针技术检测EGFR基因外显子19 del E746-A750(del Ia)、del L747-P753ins S(del Ib)突变以及外显子21 L858R、L 8 6 1 Q的突变。P CR反应体系包括:模板、正反向引物、Master Mix及Taqman标记探针del-E746-A750、del L747-P753ins S或L858R、L861Q探针。每次实验均设定各突变的阴、阳性对照孔及空白对照孔。反应循环参数为:50oC 2 min,95oC 10 min以激活DNA聚合酶;95oC 15 s,62oC 1 min,循环40次。Real-time PCR仪为美国ABI公司7500型。结果判读:以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值。没有出现扩增曲线或Ct