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水环境中细菌数量的测定 1 细菌菌群、数量、分布规律及其微生物地球化学循环 随着社会经济的快速发展，水污染已成为世界的主要问题，给人们的生产和生活带来了巨大的损害。在天然水环境中,细菌在水体及其沉积物系统中的污染物的迁移、循环和生物转化及其生物成矿方面起着十分重要的作用。针对水环境中细菌菌属、菌群、数量、分布规律及其微生物地球化学循环的研究,一直是国内外研究的热点。水体中细菌的菌群、数量和分布主要受到营养水平、温度、光照、溶解氧、盐分等因素的影响,如港湾(河流入海口)具有较多的营养物质,其水体中具有较高的细菌数。目前,水体中细菌的分布是检测水体受污染程度的一个重要指标,而研究细菌的分布情况最重要的是对细菌数量的准确测定,这对环境评估以及实际的工程应用有重要的意义。随时间、空间、地域的不同,水体中的细菌菌群、数量和分布差异甚大,而不同的计数方法测定范围、测定速度和测定结果不尽相同。因此,本文针对各种水生细菌计数方法的特点及其研究进展进行了总结,并进行了对比和评价,指出未来的发展趋势。 2 菌落计数可扩张法 水生细菌计数方法可分为间接培养计数法、直接计数法。前者是通过选择性培养基,在适宜的培养条件下对样品中的细菌进行培养进行活细菌的计数,主要包括平板菌落计数法、最可几率计数法(most probable number, MPN法,亦称为倍比稀释法)等;而直接计数法是适时、快速、准确地测定细菌总量,主要包括光学显微镜、荧光显微镜等技术、最可几率数-聚合酶链式反应法(combined the most probable number with polymerase chain reaction, MPN-PCR法)、混浊度(比浊)计数法、电阻抗法以及流式细胞仪测定法等。 2.1 含菌数的算法 平板菌落计数法是传统的细菌计数方法,可分为稀释平板法和涂布平板法,是根据微生物在固体培养基上所形成的菌落是由单细胞繁殖而成的,一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品准确地按比例进行一系列稀释,再取一定量的稀释液接种到培养皿中,使其均匀分布于培养皿中的培养基上,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,从平板上的菌落数及其稀释倍数就可换算出样品中的含菌数。平板菌落计数法测定的细菌数量是样品中可培养细菌的数量,即活菌数,研究细菌各种生理生化特性常用该法,其具有成本低廉、方法简单、操作方便的特点。值得指出的是:该法耗时较长(多为数天),无菌操作要求严格,手续繁琐,劳动强度大,测定结果受培养条件等因素的影响;样品中含菌量过少时并不能代表整个样品的含菌量情况;因培养法只能验测活菌,不适用于检测环境样品中细菌的总量。 2.2 细菌数量的测定 MPN法也是一种早期检测微生物数量的方法,它是根据概率统计学的方法来推算水样中某种待测菌的数量。1959年Jannasch等用这种方法来推算水体细菌的数量,其方法是:将待测水样进行一系列的梯度稀释后,分别吸取一定的体积于适量液体培养基试管中进行培养,记录有细菌生长的试管数,查MPN表来推算水样中活菌的数量。该法成本低廉,方法简单,操作方便;但是耗时长,操作较为繁琐,劳动强度大,只能用于可培养的细菌进行的活菌计数,且基于统计学的计数准确度不高。 2.3 细菌计数法细菌计数法 光学显微镜计数法中最常见的是血球板计数法,即用血球计数板在光学显微镜下进行细菌总量的直接计数(包括死菌与活菌)。该法是对血球板一定方格内细菌统计计数,再计算出1 mL菌液所含的菌体数。实验时,可直接蘸取少量菌悬液点在计数板上,用光学显微镜下观察计数,也可以在菌悬液中加入染色液(如美蓝染色液),数分钟后在光学显微镜下观察计数。该方法成熟、快速,且成本低廉,操作简单,但干扰较大,且无法区分活菌体和死菌体,常在准确度要求不高时选用。 2.4 功能装置的优点 荧光显微镜技术的应用使细菌的观察、鉴定和分析进入了一个新的时代,具有快速、劳动强度小、结果稳定、准确度高等优点。目前,荧光显微镜计数法主要包括荧光染料直接计数法、荧光原位杂交计数法和荧光免疫染色计数法等。 2.4.1 daps法及细菌计数方法 在生物染色剂中,有一类可被激发而发射荧光的染料,统称为荧光染料。常见的荧光染料直接计数法有AO(acrodine orange,吖啶橙)染色法和DAPI(4, 6-diamidino-2-phenylindole,4, 6-联脒-2-苯基吲哚)染色法。荧光染料AO和DAPI可与细胞中的DNA和RNA特异结合,在特定波长光的激发下发出荧光,便于染色后的细菌在荧光显微镜下观察。AO染色法最早由Fransiseo于1973年使用于天然水体中的细菌总数的计数,建立了AO染色法的基本体系和步骤。1977年Hobbie等进行了改进,其操作方法是:取水样加入甲醛固定后,以A