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污水处理厂活性污泥微生物的研究 活着的泥浆是污水处理厂暴露池中有机污染物转化的主体。其生物活性的根本上决定了污水处理厂的污水处理能力，活性废水的生物活性主要取决于微生物群落的结构和功能。活性污泥中的微生物主要由细菌、放线菌、真菌以及原生动物和后生动物等构成, 其中细菌是最主要成分。因此,活性污泥微生物菌群研究一直是环境科学、生态学和环境工程等领域的研究重点。 20世纪80年代之前,活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方法从活性污泥中发现的主要优势菌群有:动胶杆菌属(Zoogloea)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、不动杆菌属(Acinetobcter)、螺菌属(Spirillum)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)和假单胞菌属(Pseudomonas)等。但是后来大量研究发现,在活性污泥中经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的1%～15%。因此,对活性污泥菌群新研究方法的探索是20世纪80年代的当务之急。 20世纪80年代后期,随着以16S rRNA为主要基石的细菌分子分类学的发展,PCR技术、电泳技术、克隆文库技术、荧光原位杂交(FISH)和流式细胞术(FCM)等免培养的分子生物学技术(cultivation-independent technique)逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段,活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识,大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现,如:具有除磷作用的类红环菌(Rhodocyclus)、小月菌(Microlunatusspp.)、类Tetrasphaera的棒状菌、俊片菌(Lampropediaspp.)等;具有脱氮作用的反硝化生丝微菌属(Hyphomicrobium)、固氮弧菌属(Azoarcu)相关菌、类硝化螺菌(Nitrospira)等;与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌(Nocardioform actinomycetes)、丝状菌(Microthrix parvicella) 和Nostocoida limicola等。 免培养技术的出现和完善,使环境微生物学家能够直接使用污泥材料研究和了解活性污泥菌群的结构和丰度,活性污泥中许多建立在16S rRNA基础上的新的微生物类群被人类认识,这大大加深了人们对活性污泥菌群结构的认识。为了深入了解免培养法发现的大量新的菌群的生理特性和作用机制,20世纪90年代后期许多模拟活性污泥菌群生存环境的现代培养技术开始发展,且已成功培养了一部分传统分离培养技术不能培养的新培养物,这无疑将把人们对活性污泥菌群的研究推向一个新的层次。 1 平板分离法热法 传统的分离培养法是将定量样品接种于高浓度营养物的选择性培养基中,对生长的菌落计数,并通过观察各种微生物的生理生化特性及形态构造等进行种属分类鉴定。作为微生物研究的经典手段之一,分离培养方法在研究活性污泥菌群过程中起到十分重要的作用。 1964年Dias等采用平板分离法从活性污泥的7个样品中分离了300多个菌株,其中最占优势的是动胶杆菌属和丛毛单胞菌属。Benedict等于1971年从实验室和城市污水处理厂的两种活性污泥样品中培养、挑取129个菌落,经鉴定主要有不动杆菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、丛毛单胞菌属、黄杆菌属、假单胞菌属等。 此法要求比较简单,很适合用来分离一些具有一定功能的微生物,还常用于一些科研工作者的初步研究。但是此法有很大的局限性:①培养基对某些菌群的选择性;②某些细菌和其它细菌之间有共生现象,不能单独生长(此类细菌占至今未能培养微生物的很大一部分);③很多细菌具有难以分辨的相似形态、生理生化特性。所以,此方法不能真实的反映活性污泥菌群结构,尤其是对那些具有重要功能仍未能培养的菌群的检测。 2 细胞细菌分离 生物标记物法(biomarker)是在分类学上通过细胞特有的脂肪酸、呼吸醌等“环境样品信号”来表征、区分和鉴定细菌属、种和株等的方法。此方法可以避免形态观察方法带来的人为误差,从而进行定性定量分析。 2.1 脂肪酸图谱法 常用的脂肪酸图谱法可分为两种:磷脂脂肪酸(PLFAs)图谱法和全细胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)图谱法。前者的优点是准确、可靠;而后者的优点是提取简捷,所需样品量少。脂肪酸异丙酯(FAPEs) 图谱法是最近发展的一种脂肪酸图谱法,采用强度更低的试剂(酸性异丙醇)和更简便的处理方法将提取的脂肪酸异丙基化,分析的对象是脂肪酸异丙酯。脂肪酸通常具有属的特异性, 不同微生物具有不同的脂肪酸种类和数量,因此,可以通过脂肪酸谱图分析来快速有效监测群落的微生物结构变化。 Werker等同时采用MIDI-FAME图