卫生化学课件—细胞电生理学与膜片钳技术.pptVIP

The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991) ??????????????? ??????????????? Erwin Neher Bert Sakmann ??? 1/2 of the prize ??? 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut für medizinische Forschung, Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944 b. 1942 膜片钳技术 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米) 膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流， 从而了解离子运输、信号传递等信息。 基本原理 利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。 膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（ 10ＧΩ ）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。 由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面积仅约1μｍ2,离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。 膜片钳技术的优点 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。 膜片钳记录的各种模式 根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主要分为４种模式 。首先建立的单通道记录法（Single channel recording）是细胞吸附式，其后又建立了膜内面向外和膜外面向外的模式；还有一种是全细胞记录法（Ｗhole cell recording）的全细胞式。现在又发展了开放的细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式 ，以及穿孔膜片的模式。 Patch clamp-whole cell 细胞吸附膜片(cell-attached patch mode) 一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录的模式。优点是不破坏细胞的完整性, 内环境保持正常。缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面。但是，如果膜片离子通道对浴液中的刺激物有反应，则可以说明这种刺激物是经过某些细胞内第二信使的介导间接地起作用。 内面向外膜片(inside-out patch) 在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down （或run-up）现象。 全细胞记录式(Ｗhole-cell recording) 在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。 * 细胞电生理学与膜片钳技术 1991 Nobel基金会的颁奖评语： 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 2、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学 1、细胞电生理学 OUTLINE 细胞电生理学 Electrophysiology 细胞生理