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药用植物罗汉果组培苗玻璃化研究 罗氏戈罗夫是中国独特的腐殖藤本植物。这种水果经过处理，可以缓解咳嗽、粘液、润肠排便等疾病。同时, 罗汉果甜甙是一种低热量高甜度的天然甜味剂, 用途非常广泛。近年来, 我国越来越多的企业加入到生产罗汉果的行列, 因此, 罗汉果种苗 (组培苗) 市场需求量很大。为此一些科学工作者进行了罗汉果组培快繁研究, 旨在探索其种苗的工厂化生产。然而在罗汉果组培快繁过程中, 再生芽容易出现鲜绿透明的水渍状, 即玻璃化现象, 玻璃化的苗由于组织畸形, 分化能力降低, 不易成活, 因此不宜用作继代和移栽的材料。玻璃化苗的成因很多, 包括了培养基成分及培养条件的影响等, 本文对罗汉果组培苗玻璃化现象的影响因素进行了研究, 以期为预防罗汉果玻璃化苗的产生和提高罗汉果组培苗的质量提供理论基础和有效措施。 1 材料和方法 1.1 材料表面 试验材料为广西壮族自治区药用植物园选育并通过省级审定的青皮果系列罗汉果新品种永青1号。 1.2 菌株的培养和处理 从试验田里取罗汉果刚现蕾的幼嫩茎段, 去掉较大的叶片, 剪成1.0~2.0cm长的带芽茎段, 保留叶柄基部, 在加有1%洗衣粉的洗涤液中浸泡5~8min, 用细流水冲洗15min。在超净工作台上用75%酒精消毒10~40s, 无菌水冲洗3次, 0.1%升汞灭菌5min, 无菌水冲洗4次。选择不变色、无褐化的茎段横切成面积约0.8cm×1.2cm的带芽小块, 接种在MS+1.2mg/L 6-BA+26g/L蔗糖+5.0g/L琼脂的诱导培养基上, p H5.8, 于25℃、光照时间为12h/d (日光灯, 光照强度2000lx) 的条件下培养3周后, 选取健康无菌的丛生芽进行继代培养。取继代培养3周后的组培苗 (株高1.5~2.0cm) 接种于MS基本培养基, 以6-BA浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度、培养温度和光照时间为试验因子, 设置不同处理进行试验。在添加0.5mg/L 6-BA、4.5g/L琼脂, 蔗糖浓度设置20、25、30g/L的3种处理。在添加0.5mg/L6-BA、25g/L蔗糖, 琼脂浓度设置4.0、4.5、5.0g/L的3种处理。在添加25g/L蔗糖、4.5g/L琼脂, 6-BA的浓度设置0.1、0.5、1.0mg/L的3种处理。培养温度设置22、26、30℃的3个处理。在光强2000lx下, 光照时间设置10、12、14h/d的3个处理。每个处理接种15株苗, 重复3次。培养20d后, 观察组培苗出现玻璃化的情况。 2 结果与分析 2.1 蔗糖浓度对罗汉果生长的影响 糖作为碳源, 除为细胞提供合成新化合物的碳骨架和能源之外, 还起到维持一定渗透压的作用。当蔗糖浓度为20g/L时, 罗汉果组培苗玻璃化率高;蔗糖浓度为25g/L时, 罗汉果分化植株健壮, 丛生芽多显著高于其他处理, 玻璃化率显著低于其他2个处理;蔗糖浓度为30g/L时, 芽的分化受到抑制 (表1) 。 2.2 培养基玻璃化率随用量的变化 培养基中琼脂的浓度直接影响培养基的硬度, 硬度不同, 植物对水分和营养物质吸收的程度就会不同, 从而导致植物生长状况的不同。本试验随着琼脂浓度的增加, 罗汉果组培苗的玻璃化率明显下降, 增殖系数也下降。当琼脂浓度为4.0g/L时, 培养基呈半固体状, 瓶苗叶片皱缩卷曲, 呈不正常的水渍状, 玻璃化现象严重;当琼脂浓度为4.5g/L时, 罗汉果分化植株健壮, 丛生芽多, 玻璃化率相对较低;当琼脂浓度为5.0g/L时, 培养基中无玻璃化苗, 但大部分组培苗出现萎蔫现象。方差分析结果显示, 琼脂浓度对增殖总苗数、芽增殖系数有显著影响, 对玻璃化苗数及玻璃化率有极显著影响 (表2) 。 2.36 不同浓度6-ba对芽增殖系数的影响 不少研究报道, 在组织培养增殖过程中, 高浓度的6-BA会导致芽苗玻璃化, 而使培养失败。6-BA浓度为0.5mg/L时, 芽增殖系数高, 玻璃化率较低;6-BA浓度为0.1mg/L时, 芽增殖系数低, 同时出现不同程度的玻璃化现象;6-BA浓度为1.0mg/L时, 芽增殖系数极低, 易出现成块的愈伤组织, 说明芽扩增能力较差, 即使有芽出来其玻璃化率也高。方差分析结果显示, 6-BA浓度对增殖总苗数、玻璃化苗数及玻璃化率均有极显著影响 (表3) 。 2.4 培养温度对罗马林全学叶片化率的影响 培养温度为26℃时, 组培苗玻璃化率最低, 且增殖系数较高;培养温度超过30℃时, 玻璃化率有所增加;培养温度低于22℃时, 罗汉果植株生长缓慢, 且芽增殖系数较低, 玻璃化率比培养温度为26℃时高, 培养温度低于18℃时, 严重玻璃化, 甚至萎蔫死亡。方差分析结果显示, 培养温度对增殖总苗数影响极显著, 对玻璃化苗数和玻璃化率影响显著 (表4) 。 2.