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大鼠心肌缺血再灌注模型制作的改进 在打开冠状动脉并将大鼠心肌缺血重新注入模型的过程中，文献报告的方法有一些改进之处。例如，在手术中，应使用呼吸器不仅应满足实验条件，还应对动物造成不必要的伤害。如果冠状动脉中断，止血后重新形成，连接线很难切割，通常会破裂左心耳，导致心脏损伤和大出血。根据文献，冠状动脉位置不同，模型中缺乏部分和损伤程度不同。本研究就上述方面对此模型建立方法进行了部分改进。 1 材料和方法 1.1 u3000材料 雄性SD大鼠,体重(300±25) g,军事医学科学院动物试验中心提供,许可证号:SCK-(军)2002-001。心电示波仪(XSJ-5汕头市无线电三厂)。大鼠随机分为假手术组和模型组,每组12只。 1.2 各组心肌组织病理学检测 1.2.1模型复制:用乌拉坦(1 g/kg)腹腔麻醉,背位固定于动物手术台上。将针形电极插入四肢皮下,连接心电图机, 记录标准Ⅱ导联心电图。胸部去毛,消毒、沿胸骨左侧旁行切口,上界为两前肢后缘连线,下界为第五肋间,依次切开皮肤、浅筋膜和深筋膜,用止血钳钝性分离肌肉,充分暴露第三、四根肋骨,用剪刀深入肌肉中间剪断第三、第四肋骨,右手持中号弯血管钳深入切口,轻轻用力向两侧撑开胸腔,即可暴露心脏,轻轻挤压右侧胸腔,借助心脏跳动之势,将心脏挤出胸腔之外,左手食指、拇指固定心尖,方向朝上偏右,充分暴露心脏,用消毒棉签轻轻拨开左心耳,从肺动脉圆锥左缘进针,进针深度控制在2~3 mm之间,从左心耳右缘中部出针,在结扎线下垫聚乙烯管(PE 50),聚乙烯管可适当涂以石蜡油,迅速结扎左冠状动脉,随即可见心脏前壁颜色变成青紫,用弯血管钳撑开胸前切口,迅速将心脏回纳胸腔,顺势用左手食指和拇指将伤口捏住,向上轻提,使胸腔形成负压,排空因开胸进入胸腔的空气,用中号肠钳夹住伤口,从开胸到关胸时间控制在1 min之内,待大鼠恢复自主呼吸,连接皮下肢体导联,记录大鼠心电图,Ⅱ导联心电图ST段弓背抬高0.2 mv以上者纳入后续实验,不符合者弃之不用。 假手术组: 冠状动脉下只穿线不结扎。结扎30 min后撤去肠钳,迅速打开胸腔,轻轻挤压大鼠右侧胸腔,挤出心脏,左手食指和拇指固定心脏,拨开左心耳,用眼科剪深入聚乙烯管中剪开结扎线,用眼科镊夹取聚乙烯塑料管,迅速将心脏回纳胸腔,从开胸到关胸时间控制在30 s~1 min之内,排出胸腔中进入的空气后,用1号丝线缝合伤口。再灌注120 min后可行股动脉取血,摘取心脏组织进行相关检测。 1.2.2心肌组织氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)染色:取预先冷冻于-20 ℃的心脏标本,沿左室长轴切成1.0 mm厚的薄片,置于1% TTC溶液中,37 ℃孵育20 min后,用4%多聚甲醛溶液固定,观察染色结果,非梗死心肌组织为红色,缺血坏死心肌组织为苍白色。 1.2.3心肌组织Nagar-Olsen染色:心肌组织石蜡切片,常规脱蜡,入明矾苏木素液10~30 s,自来水洗5 min,蒸馏水洗2次,而后碱性复红染液浸染3 min,蒸馏水洗5~10 s,丙酮洗5 s,0.1%苦味酸丙酮液迅速分化5~10 s。丙酮脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察,黄色部分为正常心肌组织,红色部分为缺血损伤心肌组织。 1.2.4统计学处理:采用SPSS10.0进行方差分析,结果以xˉ±sxˉ±s表示,P0.05为有统计学差异。 2 结果 2.1 乌拉坦麻醉 大鼠麻醉后呼吸平稳。开胸挤压心脏时,表现为四肢颤动、躁动、呼吸困难、眼球外凸。行冠状动脉结扎后呼吸深慢。再灌注期呼吸浅快,闭眼竖毛。 大鼠采用乌拉坦进行麻醉,呼吸道分泌物少,无麻醉意外发生。模型组大鼠再灌注前存活率为83%,再灌注后存活率为75%。假手术组由于单纯穿线,存活率为100%。 2.2 模型大鼠心肌冠节支表达情况 假手术组大鼠实施假手术处理后心电图ST段抬高幅度为(0.103±0.015)mv,模型组大鼠冠脉结扎后ST段抬高幅度为(0.257±0.045)mv,与假手术组有显著性差异(P0.01)(图1,见封二)。 2.3 心肌骨骼成像 2.3.1 心肌组织染色结果 染色:梗死心肌和正常心肌组织分界清晰。正常大鼠心肌组织经MTT染色染成红色,缺血再灌注后,部分心肌组织染成苍白色(图2,见封二),表明部分心肌组织出现梗死。 2.3.2 nagar-olsen染色 正常大鼠心肌组织染成黄色,缺血再灌注组大鼠可见大片心肌组织呈红染 (图3、4,见封二)。表明大鼠心肌组织出现损伤。 3 开胸径需要药物治疗 通常文献报道建立大鼠心肌缺血再灌注动物模型时需采用气管切开或者气管插管的方法,连接呼吸机给氧,同时给予阿托品抑制呼吸道分泌物。我们在实践过程发现,普通呼吸机模式简单,参数很难