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造血系统恶性疾病合并造血常见的造血意义 针对血液系统疾病的恶性疾病、恶性淋巴结和再生障碍缺血性红细胞的患者，以及由化疗和放疗引起的中性细胞缺如和吞咽细胞功能障碍的药物使用的大量广福抗生素，导致假单胞菌病和双重感染的病例逐年增多。败血症是血液病特别是恶性血液病常见的医院感染。 败血症是一类因多种病原菌进入机体血液系统后迅速繁殖、产生大量毒素, 激发机体免疫系统产生的过度炎症性反应, 致死率极高。如何深入认识败血症的发病机制, 并寻求相应的干预策略是败血症研究的重点及难点。 败血症发病机理的研究主要得益于多种动物模型的建立。动物模型的建立一方面要有良好的稳定性、可重复性, 最重要的是要能很好地模拟临床败血症的病理过程。在众多败血症动物模型中, 盲肠结扎穿孔模型 (ceacal ligation and puncture, CLP) 应用较多, 但目前尚缺乏规范、统一的操作步骤及评价标准。为了更好地将这一模型用于败血症防治研究, 我们在多次重复实验的基础上, 探索了一种成熟、稳定的败血症模型制备方法。 同时为了验证我们制备的模型与临床败血症的一致性, 我们还从动物整体死亡率, 体重变化, 炎性因子C5a、IL-6、TNF-α 、IFN-γ等变化, 胸腺淋巴细胞及肠系膜淋巴细胞凋亡情况, 胸腺及脾组织病理变化等不同方面对我们的动物模型进行了评价。 材料和方法 6-8周龄雄性C57小鼠购于本院实验动物中心, 于本院普通级动物房饲养。 检测试剂和检测方法 淋巴细胞凋亡检测试剂盒购于北京精美生物技术公司。C5a ELISA检测试剂盒购于PharMingen 公司。IL-6、TNF-α、IFN-γ ELISA 检测试剂盒购于eBioscience 公司。PE标记抗小鼠CD4+抗体购于eBioscience 公司。速眠新及氯氨酮购于福建吉田制药有限公司。抗凝剂 (ACD) 购于Baxter.Deerfield公司。手术刀片、剪刀、8号注射器针头购于北京京鹿手术器械有限公司, 缝合线、缝合针、结扎线购于上海医用缝合针厂有限公司。 麻醉温度的确定 将氯氨酮、速眠新、生理盐水按2∶1.5∶3.5体积比, 混合均匀后于4℃条件下冷藏, C57小鼠麻醉剂量为0.05毫升/只, 选用腹腔注射法进行麻醉。 盲肠远端部位联合穿刺 C57小鼠麻醉后仰卧于手术台上固定, 75%酒精消毒腹部, 剑突下一指沿腹白线用手术刀打开约2-3 cm切口。暴露腹部、找到盲肠部位, 以3-0号丝线结扎盲肠远端部位, 结扎2/3宽度, 并用8号针头穿刺肠壁2次, 挤出适量肠内容物, 将肠内容物及盲肠按原位放回腹腔, 逐层关腹, 分别缝合结扎。假手术组同样需暴露肠内容物, 但不进行肠结扎及穿孔操作。 抗凝处理 手术后不同时间点将C57小鼠进行眼球放血, 分别收集血清及血浆, 血浆ACD进行抗凝处理, 血液与ACD比为9∶1。样品收集后室温条件下5000rpm离心10分钟, 吸取上层血清及血浆, 于-80℃保存备用。 fcs/pbs包的制备 C5a、IFN-γ、IL-6和TNF-α的检测依据细胞因子检测试剂盒说明书。一抗 (1-5 μg/ml) 溶解于包被液 (碳酸盐缓冲液pH 9.6) , 100 μl/well包被ELISA亲和96孔板, 4℃放置过夜后, 10% FCS/PBS封闭2小时。用PBS-T洗板3次, 加入100 μl/well样品 (1∶10-1∶100稀释) , 室温放置1小时, 用PBS-T洗板3次, 加入Biotin化抗体 (1-5 μg/ml) , 室温放置1小时, 用PBS-T洗5次, 加入Avidin-HRP (1∶1000稀释, 100 μl/well) 室温放置半小时, 以OPD或TMB显色系统显色, 测OD492或OD450值, 根据标准曲线确定细胞因子水平。 facs液制备 手术18-20小时后动物进入炎症反应的急性期。C57小鼠眼球放血后脱臼处死, 分离胸腺组织及肠系膜淋巴结, 组织研磨后滤网过滤去除组织碎片, 细胞用FACS液洗2次备用。首先标记PE标记的CD4+抗体, 随后按凋亡检测试剂盒说明书标记FITC标记的Annexin Ⅴ 抗体, 细胞染色完成后立即用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。 胸腺及脾组织病理学检测 CLP术后20-24小时用颈椎脱臼法或眼球放血法将C57小鼠处死, 钝性分离胸腺组织及脾组织, 组织分块切割后置于10%福尔马林液中固定, 经脱水包埋处理后, 制作石蜡切片, 切片厚3-5 um, HE染色, 在光学显微镜下观察胸腺及脾组织病变情况。 动物生存率的相关性 成组设计资料均数或有一个重复变量的两因素设计的T检验, Kaplan-Meier统计分析方法比较两组动物的生存率,p﹤0.05被认为有显著性差异。 结