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建立糖尿病肾病大鼠模型方案的探讨 随着生活水平的提高和工作任务的加快，糖尿病的发病率呈上升趋势。世界上年龄组糖尿病的发病率预计为2000年2.8%，到2030年4.4%。患糖尿病人数将从2000年的1.71亿增加到2030年3.33亿。中国每年糖尿病的发病率在不断上升,患病人数仅次于印度,居世界第2位。在l9世纪初期,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)被看作是一种以尿量增多和消瘦为特征的肾病,而现在在世界范围内肾衰患者中20%~50%是由DN发展而来的。 世界卫生组织预测到2025年,大约有3亿人将患上糖尿病,其中30%~40%的人将会发展成糖尿病肾病,目前DN的防治已成为国内外研究的热点,而建立较好的DN模型是研究DN发病机制及防治的重要方面。 目前有关DN的实验研究,模型建立方法各异,单纯利用链脲佐菌素(streptomycin,STZ)注射进行诱导建立DN模型,是国内外学者们运用最多的,因为此法操作相对比较简单。近年来在研究DN的造模方法中有人对此进行了改良,采用单侧肾脏切除术后再进行STZ注射诱导建立DN。单侧肾脏切除导致保留的肾脏代偿性肥大,高过滤,肾小球毛细血管压力增大,促进糖尿病肾小球损伤。同时也有文献报道采用单侧肾脏结扎后再进行STZ注射诱导建立DN。单侧肾脏结扎,可出现与手术摘除结果相同的对侧肾脏代偿性肥大,血糖(glucose,Glu)及肾脏功能改变能够证实DN模型的成立。但不同造模方法都各有其优缺点,本实验通过手术切除和手术结扎单侧肾脏后再腹腔注射STZ建立糖尿病肾模型的方法进行比较,从而寻求一种相对理想的造模方案。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 实验动物g 选用SD大鼠雌性30只,体重(250±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,实验动物生产许可证号:SCXK(沪)2002-0001。适应性平衡饲养1周后,用于试验。 1.1.2 表面活性剂及定量试剂盒 STZ购自美国Sigma公司,-20℃保存,临用前用p H4.5的柠檬酸缓冲液配制为1%的应用液;尿蛋白(urine protein,Upro)定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所;戊巴比妥钠购自中国医药(集团)上海化学试剂公司(进口分装),临用前用生理盐水配成3%的浓度待用; 1.1.3 仪器、检测方法 罗康全优越型血糖仪及罗康全试纸(德国罗氏诊断有限公司);Hitachi7020生化自动分析仪(日本日立公司);721E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);T1000电子天平(常熟双杰测试仪器厂);OLYMPUS显微镜(日本OLYMPUS公司)。 1.2 方法 1.2.1 各组患者10只只自组织 将30只实验动物按体重随机分成3组,每组10只。分别为A组:单侧肾脏切除后STZ腹腔注射,B组:单侧肾脏结扎后STZ腹腔注射,C组:假手术对照组。 1.2.2 肾移植的联合注射 实验大鼠禁食12 h后,A、B、C 3组均腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉,注射容量为每100g体重0.15 ml,相当于剂量为45 mg/kg。确认麻醉后,A组行左侧肾脏切除术:从左侧脊柱与肋骨之角处切开皮肤及肌层,于肾门处结扎,摘除左肾,缝合肌层和皮肤。B组行左侧肾脏结扎术:沿肾蒂同时结扎肾脏动静脉及输尿管。C组大鼠切开皮肤及肌层后再行缝合。手术后2周,各组大鼠禁食18 h,A、B2组大鼠一次性腹腔注射1%STZ溶液55 mg/kg,具体给药量为每100 g体重0.55 ml,C组大鼠一次性注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。注射后大鼠自由摄食水。STZ腹腔注射后,从第1周开始监测血糖,收集尿液计算尿量,测尿蛋白,并以非空腹血糖16.6 mmol/L,尿量原尿量150%,尿蛋白排泄20 mg/24 h为成模标准。本实验中尽量避免测空腹血糖,因为空腹会造成一些血糖太高的大鼠出现酮体增多而增加死亡率。 1.2.3 肾损害量vd 大鼠注射STZ后,从第1周开始每2周称1次体重(weight,BW),测Glu,血清总胆固醇(cholesterol,Chol),甘油三酯(triglyceride,TG),血清肌酐(serum creatinine,Scr),记录尿量(volume,V),测尿肌酐(urinecrea,Ucr)、24 h尿蛋白(24-urine protein,24-Upro)。血清由大鼠眼眶内眦取血离心收集,尿液由代谢笼收集24 h尿。24 h尿蛋白(mg)=测定管吸光度/标准管吸光度×750(mg/L)×尿量(ml)/1 000。内生肌酐清除率Ccr(ml×min-1×100 g BW)=Ucr(mmol/L)×V(ml)×1/Scr(mmol/L)×1/1 440(min)×1/BW(