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几丁寡糖对烟草黑胫病菌的防治效果
1896年首次发现并由美沙那后裔引起的黑烟疾病是由烟草爆发引起的。它是世界上所有的卷烟草产区。目前,该病在我国各主要产烟区均有不同程度发生,其中以安徽、山东和河南省发生最重,并多与烟草青枯病混合发生,罹病烟株根茎腐烂,叶片枯萎,重者全株枯死。一般年份病株率为10%~20%,严重流行年份可达40%以上,对烟草生产威胁极大。多年来,生产上一直选用抗病品种和适期药剂防治的综合治理措施,对控制病害的发生起到了一定作用。然而,烟草品种的抗病性和优质性存在矛盾,同时长期大量施用化学农药已导致严重的环境污染、农药残留和病原菌产生抗药性等问题,因此,有必要寻求新的安全合理的病害防治方法。
几丁寡糖(chitinooligosaccharide)系几丁质的降解产物,是2~10个N-乙酰氨基葡萄糖以糖苷键连接而成的糖类总称。已有报道指出,几丁寡糖对多种植物病原菌具有良好的抑制作用,对环境安全,对人畜无害,且不会导致农药残留,因而具有重要的生物防治价值和广阔的开发应用前景。
目前,已有少量有关几丁寡糖对植物病原菌及其所致病害影响的研究报道。Oliveira等报道了几丁寡糖对链格孢Alternaria alternata、匍枝根霉Rhizopus stolonifer、灰葡萄孢Botrytis cinerea和扩展青霉Penicillium expansum等4种植物病原真菌菌丝生长的影响。Burkhanova等研究了几丁寡糖对由麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana引起的小麦根腐病的控制效应。然而,有关几丁寡糖对烟草黑胫病的生防作用及其机制至今未见报道。作者系统研究了几丁寡糖对烟草黑胫病菌的平板抑制活性及其对烟草黑胫病的盆栽防治效果,并对人工接种条件下几丁寡糖处理后烟草植株体内抗病酶系的活性动态进行了分析。
1 材料和方法
1.1 ph-1和tunger菌株
哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株TH-1、烟草黑胫病菌Phytophthora nicotianaevar.nicotianae(Bredade Haan) Tucker菌株Ph-1,均由本实验室保存。
烟草品种K326种子,由云南省烟草科学研究所惠赠,在无菌土中发芽7天后,移栽至含有复合肥的无菌土中,18~20℃的温室中培养至7叶龄。
1.2 几丁寡糖的制备
粗溶液的制备:采用酶解法。将10g几丁质(Sigma公司产品)在通风橱内溶解于130mL浓盐酸中,4℃下静置24h,与5倍体积预冷至4℃的50%乙醇混合,2h后,用蒸馏水冲洗至中性,并定容至1000mL,得到胶态几丁质。用提纯的几丁质酶与过量的胶态几丁质于40℃下反应3h,10000r/min离心30min以去除多余的几丁质颗粒,上清液即为杂几丁寡糖溶液。
提纯:将上清液置于高压蒸汽灭菌锅内121℃保持30min,将所有反应体系内的蛋白质变性,析出沉淀,10000r/min离心30min,上清液即为初提纯的几丁寡糖溶液。取1mL几丁寡糖溶液与3mL DNS在沸水浴中反应15min,置于UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)470nm紫外光下比色,读取吸光值,确定几丁寡糖溶液的浓度。
1.3 菌落抑菌率测定
供试烟草黑胫病菌在LBA培养基上生长5天后,用直径4mm的打孔器沿菌落边缘打取菌碟,分别接种到含0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mg/mL几丁寡糖的LBA平板上,每浓度3皿,3天后用十字交叉法测量菌落直径,计算抑菌率。
抑菌率(%)=对照菌落直径?处理菌落直径对照菌落直径×100(%)=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径×100
1.4 烟苗的复合处理
试验设以下处理:(1)木霉处理:将在PDA培养基上生长了7天的木霉用含0.1%吐温80的无菌水洗下,4层纱布过滤,将孢子悬浮液的孢子终浓度调至106个/mL,每株烟苗15mL灌根;(2)几丁质处理:烟苗用胶态几丁质30mL/株灌根;(3)几丁寡糖处理:将浓度为1.2mg/mL的几丁寡糖用小型喷雾器对烟苗进行整株喷雾;(4)几丁寡糖+木霉处理:将浓度为1.2mg/mL的几丁寡糖用小型喷雾器对烟苗进行整株喷雾,并以木霉孢子悬浮液15mL/株灌根;(5)几丁寡糖+木霉+几丁质处理:将浓度为1.2mg/mL的几丁寡糖用小型喷雾器对烟苗进行整株喷雾,并用木霉孢子悬浮液15mL/株、胶态几丁质30mL/株灌根;(6)空白对照:仅用灭菌水以小型喷雾器对烟苗进行整株喷雾,同时用灭菌水按每株15mL灌根。
以上各处理喷雾量均以植株全叶湿润、无滴液为准, 每处理12株烟苗。 在供试烟苗7叶期实施,重复3次。
接种及管理:于上述处理实施后2天接种烟草黑胫病菌。用灭菌昆虫针束刺伤(2根小号昆虫针相距2
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