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大孔吸附树脂分离纯化连钱草总黄酮的研究 连金草，又名金钱草、大冶金钱草、头骨瘦。这是嘴唇科植物的血灵丹。glecc（nakai）kubar。土壤样本于2005年，具有湿洗、清热解毒、分散和囊肿的功能。在民间被广泛应用于治疗尿路感染、感冒、跌打损伤、风湿性关节炎、腹泻等。连钱草中的主成活性成分为黄酮类, 有松樟酮 (pinocamphone) 、薄荷酮、异薄荷酮、番薄荷酮 (pulegone) 等。近年来对于连钱草有效成分的研究日益增多, 但尚未见连钱草总黄酮分离纯化的研究报道。本实验旨在通过对大孔吸附树脂分离纯化连钱草总黄酮的工艺条件进行系统的研究, 为连钱草制剂的研制、开发和生产奠定一定的基础。 一、 药品、试剂和试剂 分光光度计[Agilent 1100, 美国安捷伦 (Agilent) 科技公司], 树脂 (安徽三星树脂科技有限公司) ;芦丁对照品 (由中国生物制品检定所提供) ;连钱草 (广东云浮市康达医药公司提供) ;亚硝酸钠 (上海绿源精细化工厂, 分析纯) 和氢氧化钠 (青岛世纪星化学试剂有限公司, 分析纯) ;超声波清洗仪 (深圳市科工达超声设备有限公司) 。 二、 实验方法 1 线性关系的测定 采用紫外分光光度计法对连钱草总黄酮进行测定。 (1) 标准曲线的制备 精密称取1 2 0℃常压干燥至恒重的芦丁对照品20.56mg, 置于100ml的容量瓶中, 加60%乙醇约60ml, 密塞, 超声使其溶解, 放冷, 加60%乙醇至刻度, 摇匀, 得芦丁标准溶液 (0.2056mg/m1) 。精密量取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml, 分别置于25ml的容量瓶中, 分别加水6、5、4、3、2、1、0ml, 加5%亚硝酸钠溶液1ml, 摇匀, 放6min, 加三氯化铝试液1ml。摇匀, 放置6min, 再加5%的氧化钠溶液10ml, 加水至刻度, 摇匀, 以第一管作空白对在510nm处测吸光度。绘制浓度-吸光度曲线, 求出回归程为y=0.0963A-0.00014, r=0.9991, 式中Y代表照品浓度 (m g/m1) , A代表吸光度, 对照品在0～0.0493mg/ml范围内呈良好的线性关系。 (2) 上柱液的制备和连钱草总黄酮含量测定 参考文献选用乙醇做溶剂, 采用超声提取法做为样品制备的方法。取连钱草粉末约0.5g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 精密加60%乙醇60ml, 密塞, 称定重量, 超声50min。放冷, 密塞, 再称定重量, 用60%乙醇补足减失的重量, 摇匀, 过滤, 得续滤液, 即上柱液。浓缩液加入适量水, 离心过滤后得澄清连钱草提取物上柱液。精密量取供试品溶液3.0ml, 然后按标准曲线的制备项下方法测定总黄酮的含量。 2 静态吸附法 测定8种树脂静态吸附量、吸附率和解吸率, 以筛选树脂。在带塞的锥形瓶中, 加入一定量预处理好的大孔吸附树脂和浸出液于室温下振荡, 每隔1h测定吸附前后连钱草总黄酮浓度的变化, 计算各树脂的静态吸附容量和吸附率, 然后加入60%乙醇水溶液进行洗脱, 测定脱附液中连钱草总黄酮的含量, 计算脱附率。 3 连钱草总黄酮的吸附动力学研究 取1g树脂加入40m L 1.4m g.m L-1的连钱草总黄酮溶液, 在不同时刻取少量溶液分析连钱草总黄酮浓度, 绘制吸附动力学曲线。同时取1g树脂加入40mL一系列浓度的连钱草总黄酮溶液, 进行吸附实验。测定吸附前后的溶液浓度, 计算树脂吸附量, 得到等温吸附曲线。 4 洗脱剂和清洗条件的选择 对已经吸附样品的树脂进行脱附实验, 作出脱附曲线。考察脱附剂的种类、浓度、流速等因素对树脂脱附性能的影响, 确定最佳的脱附工艺。 三、 结果 1 吸附及脱附试验 在相同试验条件下, 测得各树脂的静态吸附及脱附结果见表1。 由表中可以看出D-101型树脂的吸附率和脱附率较高, 因此选择D-101型树脂做为研究对象。 2 连钱草总黄酮的吸附动力学关系 取1g树脂加入40m L 1.4m g.m L-1的连钱草总黄酮溶液, 在不同时刻取少量溶液分析连钱草总黄酮浓度, 以时间为横坐标, 吸附量为纵坐标, 绘制吸附动力学曲线, 见图1。从图1可见, D-101树脂在起始阶段吸附速率较大, 80min开始, 吸附量增加缓慢。 3 吸附等温线研究 分别配制不同浓度的连钱草总黄酮上柱液, 称取一定量的D-101树脂在常温下作吸附等温线, 见图2。由图2可知, 随着溶液中连钱草总黄酮浓度的增加, 树脂的吸附量 首先增加很快, 但当浓度达1.4mg.m L-1后, 增长缓慢。 4 连钱草总黄酮的洗脱效果 实验表明, 采用甲醇-水、乙醇-水等体系对连钱草总黄酮均有较好的洗脱效果。考虑到甲醇的成本与安全性等因素, 以及实际工