铁皮石斛组织培养技术研究.docxVIP

铁皮石斛组织培养技术研究 那是中国的著名中药。它被称为“中国仙女草”和“药中黄金”。这是2010年中国药典收入的主要石斛品种。具有滋阴清热、液体发生器、益胃、润肺止咳、润肠、长寿的功效。现代研究表明,铁皮石斛对治疗咽喉疾病、白内障、糖尿病和抑制肿瘤生长具有显著疗效。铁皮石斛是生产石斛夜光丸、脉络宁注射液、通塞脉片、清睛粉等数十种中成药及保健品的必要原料,以铁皮石斛加工成的枫斗在国内外享有很高的声誉。过去我国的铁皮石斛药材主要来自野生资源,过度采集使野生资源量急剧下降,濒临灭绝。同时铁皮石斛采用传统的分株繁殖法,繁殖速度比较慢,难以满足日益增长的市场需求,因此通过组织培养技术,对铁皮石斛进行快速繁殖是保护和利用铁皮石斛资源的必要途径。本实验筛选出铁皮石斛最佳外植体消毒方式、最佳培养基配方,最佳瓶苗移栽方式从而建立稳定、高效的铁皮石斛组织培养快繁技术体系,以便定时、定量、定质出苗,满足市场需求。 1 材料和方法 1.1 +icra-migo苗种培养miga 选取我国云南省普洱市山区野生铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo种苗,由河北北方学院药物研究所张进顺教授鉴定,在河北北方学院园艺温室进行栽培。选取一年生茎段作为外植体进行组织培养研究。 1.2 方法 1.2.1 发酵材料的消毒处理 选取生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株的一年生茎段,每2节为一段,放入500 m L的烧杯中,用纱布单层棚口,扎紧,冲洗30 min,冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。 将上述预处理后的材料带到无菌室超净工作台上,并将带茎段的腋芽的苞叶拨去,分别采用3种消毒方式进行消毒灭菌2次,3种消毒方式见表1。 污染率=污染的个数/接种的个数 1.2.3 原球茎诱导培养 用得到的无菌体系进行培养,待苗长至3~4节茎段时,剪取其带芽茎段,叶片去掉,作为外植体,进行原球茎的诱导培养。 原球茎诱导培养基设计见表2,基本培养基为MS+2%活性炭(AC),激素配方采用6-BA和NAA的完全随机设计,共8个处理,每个处理5个重复,每个重复5瓶培养基,每瓶接入5个茎段。45 d调查原球茎的诱导率及原球茎数量。 原球茎的诱导率=产生原球茎的茎段数/接种茎段数 1.2.4 激素的增殖能力 将诱导形成的原球茎接种在原球茎增殖培养基上。基本培养基为MS+2%活性炭(AC),激素配方采用BA和2,4-D的完全随机设计,处理方法见表3,共9个处理,每个处理5个重复,每个重复5瓶培养基,每瓶接入原球茎5块。然后在无菌条件下进行增殖试验30 d后统计增殖率。 原球茎增殖率=增殖的原球茎块数/接种原球茎块数 1.2.5 培养基与处理方法 将增殖的充分成熟的较大原球茎块切割成直径3~8 mm左右的小块,接种在芽分化培养基上。基本培养基为MS+2%AC,激素配方采用6-BA和NAA的完全随机设计,处理方法见表4,共10个处理,每个处理5个重复,每个重复5瓶培养基,每瓶接入原球茎5块,然后在无菌条件下进行分化培养,第45天统计分化率。 幼苗分化率=分化出幼苗的原球茎块数/接种原球茎块数 1.2.6 配方设计及处理 将原球茎分化出的幼苗接种于生根培养基上,基本培养基为1/2 MS+15%土豆汁+2%AC,激素配方采用NAA的完全随机设计,处理方法见表5,共6个处理,每个处理5个重复,每个重复5瓶培养基。然后在无菌条件下进行生根培养,第45天统计幼苗生根率。 幼苗生根率=生根幼苗数/接种幼苗数 1.2.7 瓶苗移植 将生根瓶苗在移栽前放在温室大棚中炼苗15~20 d后,洗净组培苗根上培养基,用0.1%灭菌灵消毒,以防栽培后的石斛苗根腐烂。。 1.2.9 ga和细菌根对类固醇移植成活率的影响 选择大苗,基质中添加GA和菌根真菌,处理方法见表7。12个月后调查不同基质铁皮石斛移栽成活率及高度和长度。 1.2.1 苔藓草的处理 选择大、中、小3种瓶苗进行移栽试验,基质为树皮块加苔藓草,基质中添加0.03 mg/L GA和菌根真菌,处理方法见表8。12个月后调查不同基质铁皮石斛移栽成活率及高度和长度。 1.2.1 温度对培养室抗褐变的影响 培养基p H值在5.4~5.8,琼脂粉0.6%~0.8%,并加入0.2%AC防止褐变,培养室温度控制在(25±1)℃,相对湿度40%,光照12 h/d,光照强度为2 000 Lx。 2 结果与分析 2.1 发酵药物处理 由表1可知,铁皮石斛带芽茎段经单一消毒剂消毒后,污染率较高;而经复合消毒剂处理后污染率显著降低。所以建立铁皮石斛无菌体系较好的消毒方式为70%乙醇处理30 s后再用0.1%Hg Cl2处理10 min。用这种消毒方式处理铁皮石斛带芽茎段可大量获得铁皮石斛的无菌苗。 2.2 -ba和6-ba对原球茎诱导率的