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转基因烟草幼苗生理高温抗热性研究 根据气候预测，温室效应促进了全球气温的上升，所有植物都面临着高温和其他挑战，植物的抗热性变得越来越重要。在高温胁迫下,植物的器官、组织、细胞、以及细胞内的细胞器结构会发生改变,植株的生理生化过程会受到影响,从而不同程度地影响植物的生长发育。MARTIREAU等指出植物在高温胁迫下的膜伤害与质膜透性的增加是高温伤害的本质之一。由于高温下细胞内的超氧自由基(O-2)、羟自由基(OH-), MDA的产生和消除的平衡受到破坏,而造成O-2,OH-和MDA的积累,引起膜中蛋白质聚合和交联以及膜中脂类的变化,从而直接影响膜的流动性和透性,对植物造成伤害。吴国荣等用生理高温处理佛州侧耳时,发现佛州侧耳呼吸速率增大,吸收O2的速率增加,产生O-2的速率随之同步增加,SOD活性就逐步升高。生理高温是指介于植物生长的最适温度与最高温度之间的高温。持续的生理高温会不同程度地影响生物的生长发育和新陈代谢。 烟草(Nicotiana tobacumL.)起源于热带,是一种很重要的经济作物。烟草属于喜温作物,其一般生长适宜温度为 25～28 ℃,如遇较长时间高温胁迫下,其生长发育会受到不同程度的影响,特别在幼苗生长时期,受到的影响最为明显。提高植物耐热性的方法有多种,其中有效途径之一是培育转基因耐热植物。例如,通过转基因方法,提高植物抗氧化酶(如SOD,CAT)活性,能够有效清除积累的活性氧类物质,从而可能提高植物的抗热性。鉴定植物的耐热性指标有很多种,如形态指标、生长指标、生理生化指标、分子生物学指标等。胡志辉等用种子活力测定、外观形态观察、夏季田间自然鉴定、电导率、叶绿素测定等方法评价辣椒新品种的耐热性。本文以两个转基因烟草品系和一个非转基因品系作为试验材料,用生理高温(38±1) ℃处理供试烟草品系幼苗,通过观察和测定有关形态、生理生化指标及生物量,初步评价转基因烟草的抗热性。 1 材料和方法 1.1 烟草品系的表达 转基因Mn-SOD高表达烟草品系(简称Mn-SOD高)、转基因POD高表达烟草品系(简称POD高)和非转基因烟草对照品系(简称非转基因)。 1.2 生理生化指标 选生长基本一致的盆栽7～8叶龄的烟苗,每个品系30株,分为处理组和对照组。各设5次重复。将处理组幼苗置于恒温箱中,每天10∶00～17∶00控温为(38±1)℃,其余时间让其在自然温度下生长。对照组烟苗在自然条件下生长。分别在高温处理 3 d(T3)和 6 d(T6),以及高温处理 3 d 后恢复生长 4 d(T3-H4)、高温处理 6 d 后恢复生长 4 d(T6-H4)和高温处理 6 d 后恢复生长 8 d(T6-H8),取样测定相关生理生化指标。用处理/对照的百分比表示生理高温对供试品系的影响。 1.3 材料的恢复生长 待高温处理 3 d 的材料恢复生长 10 d(H3-10),高温处理 6 d 的材料恢复生长 10 d(T6-H10)及高温处理 6 d 的材料恢复生长 20 d(T6-H20)后,将烟苗连根拔起,洗净泥沙,自然晾干,称重。用处理/对照的百分比表示生理高温对供试品系的影响。 1.4 电导率的测定 用NBT光化还原法测定SOD活性。用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量。用硫代巴比妥酸法测定丙二醛和可溶性糖含量。 质膜透性的测定:用打孔器取10个烟叶小圆片(避开大叶脉)于 20 mL 刻度试管中,加入超纯水至刻度处,然后置于真空干燥器中用真空泵分两次共抽气 60 min,使叶圆片沉于水中。取出摇匀,用电导仪测定其电导率;然后置于沸水中煮 15 min,自然冷却后加超纯水至刻度,摇匀后测定电导率。用相对电导率(第1次电导率值/第2次电导率值×100%)表示细胞质膜透性的大小。 2 结果与分析 2.1 高温处理对烟苗激发叶片的影响 生理高温对烟苗叶片都产生了不同程度的伤害。高温处理 3 d 的烟苗基部少数叶片表现出一定程度的萎蔫,伤害较轻。高温处理 6 d 的烟苗基部多数叶片表现出明显萎蔫,部分叶片由绿色变为浅黄色、黄色,甚至有一部分叶片脱落。由此看出,所用生理高温(38±1) ℃对烟苗生长有胁迫作用,而且高温处理的时间越长,胁迫作用越明显。 2.2 在烟苗生理高温处理后生长情况 据图1可知,生理高温处理时间越长,烟苗生长受到的伤害越大,恢复正常生长需要的时间越长。例如,POD高T3-H10为97.47%,T6-H10为72.73%。由此可见,与生理高温处理 6 d 的烟苗相比,生理高温处理 3 d 的烟苗更容易恢复正常生长。 比较生理高温处理后的烟苗恢复生长情况,发现3个供试烟草品系恢复生长的速度由大到小排列为:POD高 Mn-SOD高非转基因。例如,POD高T6-H10为72.73%,Mn-SOD高T6-H10为65.93%,非