大鼠神经源性膀胱后尿流动力学改变及c改变.docxVIP

大鼠神经源性膀胱后尿流动力学改变及c改变 神经源性膀胱（ngb）是临床上常见的膀胱功能障碍之一，也是脊柱损伤的常见原因之一。主要有两种类型:骶髓损伤(sacral cord injury,SCI)和骶髓上损伤(suprasacral cord injury,SSCI),骶髓损伤会导致逼尿肌无反射(detrusor areflexia,DA);而骶髓上损伤会导致逼尿肌反射亢进(detrusor hyperreflexia,DH)。但是引起逼尿肌亢进和无反射的发病机制目前一直存在争论。肌源性学说作为其主流学说之一,指出逼尿肌肌源性兴奋性增加是其重要的发病机制。而肌源性兴奋的快速传递是通过缝隙连接介导的,缝隙连接主要由连接蛋白组成,其中主要为Connexin43(Cx43),其表达的改变可反映缝隙连接的改变。2009年3月至2010年4月本实验通过免疫组化及Western blotting检测Cx43在逼尿肌反射亢进和无反射膀胱中的表达变化,探讨Cx43与神经源性膀胱发病机制的关系。 1 材料和方法 1.1 动物分组及分组 本实验共用成年健康SD雌性大鼠52只,随机分为对照组12只、骶上脊髓损伤组(DH组)20只、骶下脊髓损伤组(DA组)20只,购自于辽宁医学院动物中心。 1.2 脊突加研磨法 骶上脊髓横断模型建立:10%水合氯醛(CH,0.03 mL/kg)腹腔注射麻醉。以第13浮肋相连接的T13作为骨性标志,纵行切开背部皮肤约2 cm,钝性分离皮下,尖刀片紧贴棘突骨面两侧行椎旁肌纵行切开,咬除L1-2椎板至横突根部,于L1-2处打开硬脊膜,以尖刀片自脊髓左侧至右侧快速划断脊髓,两断端之间填充明胶海绵,止血后依次关闭各层。手术后腹腔注射庆大霉素5 000 U/kg,1次/d,持续7 d。 骶髓损伤组钝性分离背肌后显露S1~S2,脊突和椎板。以椎板咬骨钳咬除L7~S1脊突和椎板。显露出硬脊膜后以眼科剪横断硬脊膜和脊髓,其他基本与骶髓上损伤组的处理相同。对照组不做让任何处理。手术后每只老鼠单笼饲养,采用Crede手法,于体表膀胱上方挤压膀胱协助排尿、排便,3次/d。 1.3 膀胱顺应性测试 4周后实施尿流动力学检测:水合氯醛0.03 mL/kg腹腔注射麻醉,经下腹部切开皮肤找到膀胱于膀胱顶部插入与测压导管相接的硬膜外导管,经三通管分别与尿动力仪及微量灌注泵相连,以0.2 mL/min的冲水速度做充盈性膀胱测压,膀胱顺应性=灌注量/漏尿点压力。根据尿动结果,筛选出实验组DH及DA大鼠。 1.4 前卡式器官槽设计 全切膀胱,立即放入4℃ Kerb营养液中,取膀胱体部组织,纵行切成10 mm×3 mm×3 mm 肌条。取一根肌条,两端以丝线结扎,一端通过器官槽底部的小钩与微调螺旋相连,另一端与拉力传感器感应头相连。器官槽内充满37℃恒温的Kerb液,液体中通以95%O2和5%CO2混合气体。设置记录软件参数,具体参数为:张力模式,扫描速度10 s/div,灵敏度0.75 g,时间常数直流。采集频率400 Hz,滤波频率30 Hz。进行以下试验。 1.4.1 逼尿肌的收缩 先使肌条处于完全放松的无张力状态,调节微调螺栓旋,逐渐缓慢牵拉肌条直至其出现收缩,记录使逼尿肌出现收缩时的最小张力,此张力的大小反映逼尿肌对可兴奋刺激的阈值。 1.4.2 检测一定的负荷压力下迫使尿肌收缩的频率 调节微螺旋,牵拉肌条至张力为1.25 g时固定肌条长度,检测逼尿肌的收缩频率,频率越高反映逼尿肌的兴奋性越高。 1.5 免疫组化 1.5.1 试剂 Cx43一抗(多克隆兔抗鼠),二抗(多克隆羊抗兔),DAB显色液,均购于武汉博士德生物工程有限公司。 1.5.2 方法 标本经石蜡切片厚5 μm。免疫组化方法采用SP方法。Cx43一抗浓度1:100,DAB显色,苏木素复染。 1.6 免疫组化处理 取冷冻膀胱标本抽提总蛋白,测定浓度后-70℃冻存备用。先后灌制十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺分离胶和积层胶,加电泳缓冲液后,加样,电泳完毕后将蛋白转印于硝酸纤维素膜上,脱脂奶粉封闭膜后加入兔抗Cx43多克隆抗体,4℃过夜;洗膜,加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,洗膜后加入DAB显色。蛋白的检测均以PBS替代一抗作为阴性对照,以内参(β-actin)作为阳性对照。 1.7 统计方法 采用SPSS 13.0 统计软件,均数比较采用t检验,各参数间相关性分析使用Spearman相关分析。 2 结果 2.1 死亡率 DH组死亡4只,DA组死亡6只,推测原因可能为术后感染,术后尿潴留,术后肠梗阻所致。 2.23 两组逼尿肌漏尿点压情况比较 DH组逼尿肌漏尿点压较对照组、DA组明显升高,差异有统计学意义(P0.01),DA组逼尿肌漏尿点压较对照组明显下降,差异有统计学意义(P0.01);D