m6A识别蛋白HuR调控lncRNATRG-AS1抑制结直肠癌生长的机制研究.docxVIP

? ? m6A识别蛋白HuR调控lncRNATRG-AS1抑制结直肠癌生长的机制研究 ? ? 柴小兵，张利，褚菲菲，吴慧丽 结直肠癌（CRC）是一种侵袭性癌症，发生在结肠或直肠，是全球第三大常见恶性肿瘤［1］。尽管治疗CRC可采取手术、化学疗法、放射疗法和分子疗法，但CRC患者的存活率仍然较低［2-3］。因此，深入了解CRC的发病机制对于制定新的治疗策略和改善CRC患者的预后具有重要意义。近年来，RNA甲基化修饰尤其是N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修饰被证实在肿瘤的进展中发挥重要作用。m6A甲基化修饰是一个动态过程，主要受甲基化转移酶复合物、去甲基化酶、结合蛋白的调控［4］。人类抗原R（HuR）是m6A甲基化修饰的识别蛋白。HuR在CRC中高表达，沉默HuR可抑制CRC细胞转移［5］。但其具体调控机制尚不完全明确。生物信息分析显示，长链非编码RNA（lncRNA）T细胞受体γ位点反义RNA1（T cell receptor gamma locus antisense RNA1，TRG-AS1）上存在m6A位点，且TRG-AS1能与HuR蛋白相互作用。相关研究显示，沉默TRG-AS1可明显抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭［6］。但HuR能否通过调控TRG-AS1影响CRC细胞恶性生物学行为尚不明确。因此，本研究旨在探究HuR对CRC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料 收集2019年5月—2021年5月在郑州大学附属郑州中心医院首次确诊为CRC患者的癌组织以及距离癌组织3 cm处的癌旁组织，共19对。所有组织收集后立即冻存于液氮中。患者均签署知情同意书，本研究得到郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会的批准（伦理号：201901）。人正常结肠上皮细胞NCM460及CRC细胞HCT116、SW480、LO?VO均购自上海佰晔生物科技中心。35只5周龄的雌性BALB/c裸鼠购自广州锐格生物科技有限公司［生产许可证号：SCXK（粤）2021-0059］。HuR小干扰RNA（si-HuR，序列：5′-UCAAAGACGCCAACUUGUA-3′）及其阴性对照（si-NC，序列：5′-UAAGGCUAUGAAGAGAUAC-3′）、HuR过表达物（OE-HuR）及其阴性对照（OE-NC）、TRG-AS1过表达物（pcDNA-TRG-AS1）及其阴性对照（pcDNA）均购自河南睿英生物公司；DMEM培养基、胎牛血清购自武汉益普生物公司；EpiQuik M6A RNA甲基化定量检测试剂盒（比色法）购自厦门慧嘉生物公司；CCK-8试剂盒购自杭州昊鑫生物公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自翌圣生物科技公司；兔源一抗HuR、m6A、IgG、GAPDH及羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司。ABI-7500实时荧光定量PCR仪购自北京赛百奥科技有限公司；蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；FK-SY96A酶标仪购自山东方科仪器有限公司；流式细胞仪购自上海睿钰生物公司；XDS-100D型倒置光学显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 将NCM460、HCT116、SW480、LOVO细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2条件下培养。 1.2.2 比色法检测m6A含量 按照EpiQuik m6A RNA甲基化定量检测试剂盒（比色法）说明书检测组织和细胞中的m6A含量。 1.2.3 实时荧光定量PCR（qPCR）检测组织和细胞中TRGAS1表达 使用TRIzol提取组织和细胞中RNA，将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板在ABI-7500实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。反应体系：上、下游引物各1μL，cDNA模板1μL，SYBR premix 10μL，补无菌水至总体积为20μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，共45个循环。以GAPDH为内参，通过2-ΔΔCt法计算TRG-AS1的表达水平。引物及序列见表1。 Tab.1 qPCR primer sequences表1 qPCR引物序列 1.2.4 Western blot检测组织和细胞中HuR蛋白的表达 在冰上用RIPA裂解缓冲液裂解组织匀浆和细胞30 min，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，通过BCA试剂盒检测蛋白质浓度，将30μg蛋白质进行10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳分离后将蛋白质转移到PVDF膜上，再用5%脱脂奶粉封闭1 h，经TBST洗涤后，将PVDF膜与一抗HuR（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4℃下