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四醚脂质体的分离纯化及其在模拟肠液中的稳定性研究 0 脂质体的筛选和纯化 生物大药物（如蛋白质、肝脏等）的生物利用率普遍较低。原因之一是，蛋白或核酸等分子很难在严格的胃环境中不稳定，并且容易被胃肠道的酸性环境、各种酶和甘氨酸分解。为了避免蛋白或核酸药物遭受胃肠道中物质的攻击,研究人员选用不同载体来保护这些生物活性药物。 脂质体由于大小、表面电荷以及膜流动性的可控,作为口服载体的研究备受青睐。以酯键构成的磷脂制备的普通脂质体(conventinal liposomes),能够装载多肽或核酸药物,并对它们具有一定的保护作用。比如,以卵磷脂为主要成分制备的普通脂质体能够避免胃肠道中磷脂酶对装载药物的水解。然而,普通脂质体作为口服输送载体,目前面临的最大障碍之一就是:它们在肠道胆汁盐的作用下极不稳定,尤其是胆汁盐与肠道酶协同作用时。因此,我们期望寻求更加稳定的脂质体用于口服输送生物活性药物。 古细菌脂质体是由古细菌细胞膜上提取的醚脂制备而成。根据醚脂结构中醚键的数目,一般分为二醚脂质和四醚脂质。醚脂具有天然独特的结构特征(饱和植烷链以及醚键等),由其形成的古细菌脂质体在抗氧化及抵制酶或化学水解等方面较普通脂质体更具优势。最近几年的研究也证实,一些古细菌脂质体作为注射疫苗的载体,在体内能够诱导有效的免疫学反应。 本研究中,我们首先从古细菌Sulfolobus acidocaldarius中分离和纯化极性脂质抽提片段(polar lipid fraction extract,PLFE)。PLFE由glycerol dialkyl glycerol tetraether(GDGT)和glycerol dialkyl nonitol tetraether(GDNT)两个四醚脂质组成(图1)。其次,以PLFE为脂质膜材料制备了古细菌脂质体:四醚脂质体(archaeosomes)。我们以前的研究已表明,四醚脂质体在体外模拟胃环境的人工液中(0.9%NaCl,p H=2)是相当稳定的,本研究着重考察四醚脂质体在体外模拟肠环境中的稳定特征。 1 材料和方法 1.1 材料 S.acidocaldarius由中国科学院微生物研究所提供。卵磷脂(egg phosphatidylcholine,EPC)和胆固醇(cholesterol,Chol)从Avanti公司购买。钙黄绿素(calcein)、甘胆酸盐和牛磺胆酸盐购自Sigma公司。所有的分析级化学试剂均从上海生物工程公司购买。 1.2 紫外分光光度法 S.acidocaldarius接种在ATCC1733培养液(含1 g/L葡萄糖)中,p H 2.5,置于65℃细菌培养箱内,并通过紫外分光光度计监控其生长情况。当古细菌生长至对数期时,离心收集。 1.3 粗提脂质的纯化 实验参照Lo等人的分离和纯化方法并做进一步的改进。具体如下:古细菌以氯仿/甲醇(1:1,v/v)混悬12 h后离心(1800 r/min,6 min)收集粗提脂质;粗提脂质以氯仿/甲醇/水(65:25:4,v/v/v)溶解、过滤并浓缩;浓缩液以6倍体积的冷丙酮沉淀3次;接着沉淀以少量的氯仿/甲醇/水(65:25:4)溶解后通过薄层制备层析(20×20 cm)进一步纯化,展开剂为氯仿/甲醇/水(65:25:4);刮下Rf≈0.2处的硅胶带并以氯仿/甲醇/水(1:2:0.8,v/v/v)洗脱、浓缩;最后,浓缩液以冷甲醇沉淀3次。实验过程中,丙酮溶解、甲醇溶解以及甲醇沉淀的最终产物均以薄层分析层析检测。 1.4 脂质的性能 纯化的样品以1 N甲醇-盐酸于75℃下孵育18 h,以水解去除极性头部的磷脂和糖基,然后进行表征。 1.4.1 核磁共振分析 在核磁管中分别加入2 mg样品、0.5 ml的氘代氯仿(CDCl3)以及1～2滴的四甲基硅烷(TMS)内标后,通过核磁共振仪(MERCURYplus 400,Varian,Inc.,USA)分析。 1.4.2 小球研磨粉的制备 分别取0.4 mg样品和溴化钾晶体(1:10,w/w),混合均匀后充分研磨成细小粉末;将混合粉末装入模具内,在油压机上压制成片,通过红外光谱仪(Paragon 1000,Perkin Elmer,Inc.,USA)分析。 1.4.3 质量分析 样品溶解于氯仿/甲醇(2:1,v/v),进行质谱(Waters Micromass ZQ2000)分析。 1.5 蒸发脂膜制备 取PLFE的储备液适量,加入50 ml梨形瓶中,再加入6 ml氯仿/甲醇/水(65:25:4)混合均匀,真空泵抽真空至压力达到0.1 MPa,水温设为50℃,120 r/min,旋转蒸发60 min后在瓶壁形成均匀透明的脂膜,充氮气使氯仿和甲醇充分挥干。按照适量的脂质浓度在梨形瓶中加入PBS溶液水合,在超声清洗