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山羊瘤胃微生物16srdna的提取 肿瘤胃的环境适合微生物的栖息地和繁殖，有许多微生物。每个丝状肿瘤胃的内容物含有1010101个细菌。饲料中的养分在肿瘤酶中蒸发和分解，最终的养分转化为肿瘤胃壁细胞并进入血液循环。它们是反刍动物能量的主要来源。尽管这些瘤胃微生物在反刍动物的消化和营养中具有重要作用,但其中99%的微生物难以获得纯培养,也使其不能被充分的开发和利用。因此对提取微生物总DNA进行分子生物学分析的免培养法能够获取瘤胃微生物更加全面完整的信息,筛选和挖掘新的功能基因及生物活性物质,为瘤胃微生物的研究提供新的技术和手段。建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法是进行微生物后续研究的基础,目前已成为国内外研究者关注的热点。瘤胃成分复杂,其中栖息着复杂多样的微生物,包括细菌、原虫、真菌和噬菌体等几大类。在提取的过程中含有较多的抑制成分,比如腐殖酸、酚类化合物等,因此从瘤胃中提取微生物的宏基因组有一定的难度,特别是样品的预处理及提取过程,一般耗费的时间比较长。如果提取的DNA中含有的较多的抑制成分、不纯化或者纯化效果不好,将影响后续的PCR、酶切等后续工作,因此不管是瘤胃宏基因组文库的构建还是瘤胃微生物的分子生物学研究,获得一种简单,快速,纯度高的DNA对后续研究尤为重要。 1 材料和方法 1.1 模型设计和合成 1.1.1 主要试剂 λDNA/HindIII Marker、DL 2000 Marker和TaqTM购于宝生物工程有限公司(大连);通用引物由宝生物(大连)有限公司合成,引物序列见表1。 1.2 方法 1.2.1 sds-pcr法 山羊瘤胃内容物总DNA的提取方法参照ZHOU等和MURRAY等方法并做了改进,具体如下:称取5个山羊瘤胃内容物各10 g并将它们混合,用PBS缓冲液稀释样品,搅拌机充分搅碎,经六层纱布过滤得瘤胃液。取10 mL瘤胃液于50 mL离心管,加10.0 mL提取缓冲液(100 mmol/L Tris·HCl,pH 8.0;100 mmol/L EDTA;100 mmol/L磷酸钠缓冲液,pH 8.0;1.5 mo1/L NaCl;1% CTAB;1% PVPP),充分混匀,加入溶菌酶(50 mg/mL)使其终浓度达到1 mg/mL,37 ℃,180 r/min振荡0.5 h;置液氮中冷冻5 min,取出在65 ℃水浴中保温至完全融化,反复冻融共3次;加入20% SDS终浓度达到2%,混匀后60 ℃保温2 h,每隔20 min颠倒混匀;13 000 r/min离心10 min,收集上清,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,轻柔混匀,13 000 r/min离心10 min,收集上清,加入0.6倍体积的异丙醇,-20 ℃放置3 h以上,13 000 r/min离心20 min,弃去上清,沉淀用70%的乙醇清洗2～3次,自然干燥,加500 μL无菌水溶解,-20 ℃冰箱保存备用。取10 μL DNA电泳检测。 1.2.2 纯度检测和d测量 用紫外分光光度计测定DNA在280、260和230 nm下的A值,根据A260/A230、A260/A280计算出DNA的浓度。 1.2.3 瘤胃微生物总dna的pcr扩增 从瘤胃微生物总DNA中扩增细菌的16S rDNA。引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,引物R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为25 μL:模板0.5 μL,正向引物(25 mol/L)l.0 μL,反向引物(25 mol/L)1.0 μL,Taq Mix 22.5 μL。反应条件:预变性95 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min,30个循环:最后72 ℃延伸10 min。 从瘤胃微生物总DNA中扩增古细菌的16S rDNA。引物F为5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′,引物R为5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′,PCR反应体系和反应条件同上。 2 结果 2.1 总dna片段 经琼脂糖凝胶电泳检测显示,提取的山羊瘤胃微生物总DNA条带较亮,但电泳胶孔中含有不明的大分子物质,并存在拖尾现象,获得的DNA片段大于23 kb,属于大片段DNA。 2.2 定了显著性检验,即测定一个结论,结果如下 经紫外分光光度计对提取的瘤胃微生物总DNA的纯度进行测定,结果见表2。瘤胃微生物总DNA的260/280的A值平均在1.260～1.464,260/230的A值平均在1.000～1.214,表明此方法提取的DNA纯度较高。 2.3 pcr扩增微生物总dna的电泳结果 进一步利用细菌和古细菌16S rDNA通用引物对提取瘤胃微生物总DNA的质量进行检测。PCR扩增微生物总DNA的