高密度发酵过程中重组大肠杆菌的应用.docxVIP

高密度发酵过程中重组大肠杆菌的应用 重组dna技术与大规模培养技术的有机结合，使大型天然蛋白质产品的原始数量不能大量生产，尤其是磺酸。目前，用于农业的药物市场增长了5.15%。2003年，全球药物市场总销售额约为2500亿元，磺酸互补蛋白产品的总销售额至少为10%。 大肠杆菌在重组蛋白质生产的过程中占主导地位。采用高密度培养技术(High cell-density culture,HCDC),也就是高密度发酵技术,提高菌体的发酵密度,最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)不仅可减少培养体积、强化下游分离提取,还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本,能极大地提高在市场上的竞争力。 这一目的的实现,除了重组菌本身的表达性质外,还必须赋予重组菌生长和产物表达的最适环境条件,包括适宜的培养基组成、合适的培养温度、pH、稳定的比生长速率、适宜的溶解氧以及营养物的合理流加等。我们实验室采用该技术,大大推动了重组人肿瘤坏死因子(TNFα),白细胞介素-3(IL-3),骨形成蛋白-2A(BMP-2A),降钙素的下游研究。 1 影响高密度发酵的几个表观因素 1.1 培养基组分与培养方法对发酵的影响 培养基的组成成分可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基。其组成元素包括C、H、O、N、S、P、Fe、Mg、K等,根据在基本培养基中的菌体生长量可以推导出每种元素获得1g/L的大肠杆菌菌体所需的无机盐(L-1):0.77g NH4Cl,0.125g KH2PO4,17.5mg MgSO4·7H2O,7.5mg K2SO4,0.64mg FeSO4·7H2O,0.4mg CaCl2。 大肠杆菌高密度发酵使用的培养基一般为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例,如果碳氮比偏小,会导致菌体生长旺盛,造成菌体提前衰老自溶;碳氮比过大,菌体繁殖数量少,细菌代谢不平衡不利于产物的积累;碳氮比较合适,但碳源、氮源浓度高,虽然发酵起始导致菌体的大量繁殖,但发酵后期菌体生长缓慢,代谢废物过多,增大发酵黏度,影响溶解氧浓度,容易引起菌体的代谢异常,影响产物合成;碳氮比较合适,但浓度过低,会影响菌体的繁殖。这就能解释为什么单纯靠增加营养物质并不能实现高密度。一般而言,大肠杆菌培养时营养的抑制浓度为:葡萄糖(50g/L)、氨(3g/L)、Fe2+(1.15g/L)、Mg2+(8.7g/L)、PO43-(10g/L)、Zn2+(0.038g/L)。 如果培养基仅仅适合宿主菌的生长对工程菌高密度发酵而言远远不够,利用合成培养基可以很容易使菌体达到高密度,但往往会发生外源基因不表达的现象。Allen和Luli曾用合成培养基培养重组大肠杆菌,菌体在很短时间(13h)达到了79g(DCW)/L,但外源基因没有表达。Jung等改变生长阶段的C/N比例,对INF-β表达影响不大,而改变诱导后补料中C/N比,则会显著影响外源基因的表达效率。Tsai等还发现,在IL-2发酵时,在合成培养基中加入亮氨酸会使甲硫氨酸被亮氨酸错误取代的几率从19%降至2%。 1.2 bmp-2m通过温度诱导型表达制备重组蛋白,并将其作为发酵核心的表达系统 重组菌的表达调控方式对发酵过程有重要的影响,高密度发酵也必须据此而采取相应的控制,遵循外源基因的表达规律和诱导后细菌的生长规律才有可能达到高密度、高表达发酵。适合作为E.coli外源基因表达的启动子有λ噬菌体启动子PL、PR、tac、trp、Ipp、lac启动子,还有一种表达方式,就是组成型表达,无任何诱导剂。从简化发酵过程操作的观点看,组成型表达系统最为简便和经济,但过早的表达产物往往会对细胞有毒害作用,使宿主菌特有的比生长速率下降,甚至会使细胞死亡,因而工程菌发酵大多还是采用可诱导的启动子,对于这种工程菌一般采用两阶段培养法,即菌体积累阶段和产物表达阶段。BMP-2A、IL-2采用温度诱导型表达体系,重组蛋白在3—4h内达到最大表达量(BMP,2.78g/L;IL-2,1.02g/L),菌体也基本停止生长,而利用tac启动子在IPTG诱导8—10h菌体还在生长,故化学诱导的重组菌高密度发酵比温度诱导型的要容易一些。 1.3 可溶蛋白的代谢 大肠杆菌的不同种和亚种对外源基因的表达产物会产生一定的影响。表达产物在大肠杆菌体内有三条路径可走,第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白也是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。因此不同的菌种所含有的宿主蛋白酶种类和数量不同,对表达的产物会有降解作用。相同培养条件下选用E.coli DH1比利用YK537和KS476表达pr