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酿酒酵母inwsc1生长曲线的测定及重组质粒的转化 耿合酶是一些种子植物（如葡萄、花生和松树）合成白尔醇和其他枸杞代谢的重要酶。大量动物试验表明,白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗突变、雌激素样作用以及免疫系统调节等多种生物活性功能。Howitz等认为,白藜芦醇能降低酿酒酵母SIRT1蛋白的米氏常数,提高DNA稳定性,使酵母寿命延长70%。这为选择酿酒酵母作为宿主菌研究芪合酶基因的表达,探索通过酵母菌发酵来生产含有白藜芦醇的酵母微生态制剂提供了理论依据。该研究在构建葡萄芪合酶基因酿酒酵母表达载体的基础上,测定了其生长曲线,掌握菌体生长规律,从而准确选定特定生长阶段的菌体,以便于重组DNA高效转化酿酒酵母。除了工程菌本身因素外,表达载体也影响基因表达产物的成本和实用价值,因此有必要进一步检测重组表达载体在酿酒酵母中的稳定性。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 生物技术实验室 酿酒酵母菌株INVSc1由西北农林科技大学生命科学学院生物技术实验室保存;葡萄芪合酶基因酿酒酵母重组质粒pYES6/CT-STS由该课题组克隆构建。 1.1.2 母提取物及葡萄糖 YPD完全培养基:2%胰蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖;选择培养基:在YPD完全培养基中加入25 μg/ml Blasticidin(杀稻瘟素,Bsd)。 1.1.3 材料和试剂 Bsd为Invitrogen公司产品;鲑鱼精DNA(Salmon Sperm DNA,ssDNA)购自Sigma;PEG4000购自Merch公司;醋酸锂为上海生工生物工程有限公司产品;其他试剂均为分析纯。试验设备有HZQ-F160全温振荡培养箱、超净工作台、7200型紫外可见分光光度计等。 1.2 方法 1.2.1 我正在接受培训 将深冻菌种在冰浴中溶解,然后用无菌接种环在YPD固体培养基中划线培养,30 ℃于恒温培养箱中培养2～3 d,使菌种复壮。 1.2.2 ypd菌液比色测定 挑取单个菌落接种于50 ml YPD液体培养基中,30 ℃、180 r/min振荡培养24 h,取扩大培养的菌液按照1∶100的接种量接种于3瓶50 ml YPD培养基中,同样条件下振荡培养,并分别于培养后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h取菌体培养悬液5 ml,以未接种的酵母YPD液体培养基校正7200型紫外可见分光光度计的零点,在波长600 nm处比色测定菌液的OD600值。以各时间点菌液的吸光光度值(OD600)为纵坐标,以培养时间为横坐标,绘制出酵母工程菌的生长曲线。 1.2.3 高效酵母转化法 根据酿酒酵母生长曲线,在其对数生长中期制备酿酒酵母感受态细胞。采用LiAc/ssDNA/PEG高效酵母转化法,将pYES6/CT-STS重组质粒转入酿酒酵母INVSc1中。用含Bsd的YPD选择培养基进行阳性转化子的抗性筛选,采用菌落直接PCR法鉴定阳性重组子。 1.2.4 培养液的制备 接种转芪合酶基因酿酒酵母重组菌到20 ml YPD培养基中,30 ℃振荡培养24 h,将培养液用无菌水稀释16 000倍。取100 μl稀释液涂布在YPD固体平板上,待平板上有菌落形成,用牙签挑取100个单克隆到固体YPD+Bsd选择培养基上,菌斑出现后统计YPD+Bsd平板上的菌斑数量,计算工程菌种质粒的丢失率,重复操作3次。 2 结果与分析 2.1 葡萄酒和发酵酶的生长曲线 由图1可知,在前6 h酵母生长处于延滞期,在6～14 h酵母生长处于对数生长期,14 h后菌体生长趋于稳定。 2.2 菌落pcr鉴定 重组质粒转化感受态酿酒酵母后,经选择培养基筛选出阳性转化子,进行菌落PCR鉴定。由图2可知,菌落PCR泳道上有清晰约1.2 kb的目标条带。这进一步说明,经Bsd抗性筛选出的阳性转化子确实携带目的片段,pYES6/CT-STS重组质粒已成功转入酵母菌。 2.3 宿主菌株的培养 按照“1.2.4”方法检测芪合酶基因重组质粒在酿酒酵母中的稳定性。在营养丰富的培养基中,酵母约90 min增殖1代,所以72 h约传了48世代。由表1可知,在YPD+Bsd筛选培养基上,菌落数均为100,说明该质粒在宿主菌中的稳定性较高。在0～72 h发酵过程中,质粒一直没有丢失,质粒在宿主菌中的稳定性达到100%。 3 酿酒酵母发酵试验 秦玉静等研究指出,不同生长时期的酵母细胞对转化率影响较大。处于对数生长中期的酵母细胞生长旺盛,细胞壁结构较稳定期细胞的细胞壁结构疏松,因此处于对数生长中期的酵母细胞的转化效果明显高于稳定期的细胞。不同的菌种有其各自的生长规律。该试验通过测定酿酒酵母INVSc1的生长曲线,确定菌体处于对数生长中期的时间及OD600值,并以此为基准点制备酿酒酵母感受态细胞,明确酵母生长