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牙种植术后牙周微生物群落的多样性分析 口腔的微生物群落相对复杂，约有700多个。而种植体植入口腔这样一个有菌的环境, 并要在这一环境中行使功能, 就要保证种植体周围微生物群落的动态平衡。有研究表明, 种植体周可疑致病菌主要为中间普氏菌、伴放线杆菌、福赛拟杆菌聚核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌和螺旋体;进一步研究发现成功种植体周与正常牙周有着相似的微生物群基础研究落, 如链球菌属、放线杆菌属、韦容球菌属、梭杆菌等。回顾文献, 多数研究致力于研究种植体周围龈下微生物群落组成, 而正常种植体周围龈下微生物群落多样性及动态变化模式方面的研究仍较少。 本文的目的是应用分子生物学的方法来研究正常种植体周围龈下微生物群落的组成及其动态变化模式, 完善牙种植体周围微生物多样性的信息, 为提高种植修复的成功率及预防种植体周围炎的发生提供参考。 1 dna的采集和pcr扩增 选择2012年2月于成都军区机关医院口腔科接受BEGO系统两段式种植体义齿修复的患者11例 (男8例, 女3例) , 年龄 (50.8±9.5) 岁。 整个操作过程由同一位口腔医师进行培训后完成。分别采集种植体穿龈部分暴露于口腔3个月时的龈沟液作为实验组, 种植体邻近的健康临牙的龈沟液作为对照组。 采用前请患者用清水漱口, 刮除取样牙颈部附着的牙石、菌斑。棉球隔湿, 轻轻吹干待测牙的颊面及颈部, 以20g左右的力量将2mm×8mm的Whatman I号无菌滤纸条前端轻轻插入样本种植体近颊点龈沟内, 遇到轻微阻力时停止, 放置40s后取出滤纸条, 迅速放入消毒好的EP管中。间隔1min后, 再用新的滤纸条重复上述操作, 多次采集龈沟液以提高样本中的DNA总量 (舍弃沾有血渍和被唾液污染的样本) 。种植牙位邻牙的龈沟液的采集方法与前者一致, 采集完毕后称重, 计算得出龈沟液重量, 做好标记, 放入-80℃冰箱中冻存备用。 采用上海康迪生物公司的DP316-微量样品基因组DNA提取试剂盒按操作说明提取龈沟液内总DNA, 随后, 使用Bio-Rad i Cycle PCR仪进行PCR扩增。 将样本总DNA进行PCR扩增, 再将PCR产物采用美国Bio-Rad Dcode sytem进行变性梯度凝胶电泳。紫外光呈像, 将DGGE凝胶中的优势条带切割分离、纯化、克隆, 再进行蓝白斑筛选, 将阳性克隆交于上海华大基因公司克隆测序, 并将所测定的16Sr DNA序列提交Gen Bank数据库进行比对, 构建系统发育树, 从而对龈下优势微生物群落结构进行分析。 2 常见微生物菌属类型 切割分离DGGE凝胶, 共得到优势条带34条, 测序结果与Gen Bank数据库比对后可按其种属分为17组, 其中包括原核类微生物 (各种口腔常见细菌、密螺旋体) 、真核类生物 (真菌类) 以及一些未获培养的菌属 (如图1) 。 原核类微生物:牙龈卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、链球菌属、月牙形单胞菌属、巴斯德氏菌属、消化链球菌属、密螺旋体菌属、纤毛菌属、梭菌属、噬二氧化碳细胞菌属、棒杆菌属、口腔古细菌;真核生物:真菌类;以及其他未获培养的菌属。各条带对应种属见表1。 3 种植体及邻近健康天然牙周围表面形态细菌群落多样性 分子生物学技术的不断发展为微生物多样性研究提供了新的手段, DGGE技术利用序列不同的DNA在凝胶中解链条件不同的原理, 进行DNA样本的扩增和电泳分离, 获取的凝胶图谱即可反映样品微生物的多样性、丰富度等特征。该技术已逐渐应用于多种口腔疾病的微生物研究, 如牙髓炎、牙周炎、龋病等。 本实验采用PCR-DGGE方法对种植术后种植体及邻近健康天然牙周围龈下群落多样性特征研究结果表明, 健康种植体及邻近健康天然牙周围龈下群落相似, 主要由月牙形单胞菌属、普雷沃氏菌属、韦容球菌属、链球菌属、梭菌属等厌氧菌属组成, 进一步证实了种植体龈沟液内细菌来源于天然牙周“细菌库”这一说法, 两者之间会互相影响互相迁移。 种植术后3个月内均可检测到有牙龈卟啉单胞菌属、密螺旋体、口腔古细菌、梭菌属等牙周可疑致病菌的存在。牙龈卟啉单胞菌作为牙周病的主要致病菌已被证实, 本实验中健康种植体及天然牙周龈下微生物群落中均可检测到牙龈卟啉单胞菌, 但并未导致种植体周围炎及牙周炎的发生, 故本实验支持牙龈卟啉单胞菌为内源性条件致病菌。值得一提的是在本实验结果中发现, 口腔古细菌在健康种植体及健康邻牙的龈下菌群中也广泛存在。有文献报道在牙周病患者的牙周袋、牙髓病患者的根尖周炎性组织和健康人群的龈袋中发现了口腔古细菌的存在, 但其是否参与感染的发生及其致病性有待进一步研究证实。 4 植体周围炎的发生机制 种植义齿的健康状况与其龈下微生物群落具有直接关系, 维持种植体周围微生物群落的动态平衡是维持种植体成功的重要条件之一, 这一动态平衡的破环是